结构生物化学/蛋白质/凝胶电泳
凝胶电泳是一种用于显示和确定纯化方案是否有效的技术，方法是测量混合物中不同蛋白质的数量。凝胶电泳的基础是具有特定净电荷的分子将在电场中移动。蛋白质迁移的速度可以量化为
其中E为电场强度，z为蛋白质的净电荷，f为摩擦动力系数。
对于球形分子，摩擦系数确定为
f = 6 π η r
其中 η 为粘度。
正如其公式所示，分子在凝胶基质中移动的速度取决于其大小、形状和电荷。分子越小，移动越快。此外，凝胶可以制成各种 wt 百分比：6%、8%、10%、12% 和 15%。较高的百分比主要用于较小的分子，较低的百分比用于较大尺寸的样品。理论上，较大的分子仍然可以使用较高的百分比，但这些凝胶可能需要很长时间才能显影。电荷也可能是特定样品在凝胶中迁移的速度和距离的因素。使用较高的电压将使样品移动得更远更快。但是，在使用较高电压时必须谨慎，因为它产生的热量可能会融化凝胶。
凝胶电泳（SDS-PAGE；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种检查样品纯度的强大工具，因为它可以检测微量的蛋白质。不同的蛋白质在凝胶用考马斯亮蓝染色（可视化约 2 pm 的蛋白质）或银染色（可视化 0.02 µg 的蛋白质）后会出现在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，形成不同的条带。
天然凝胶电泳涉及用样品在其天然状态下运行凝胶。这样，分子的电荷除了大小之外也成为一个因素。更具体地说，带电荷更多的分子将比具有可比质量的带电荷更少的分子迁移得更快、更远。同样，较大的分子将比具有可比电荷的另一个分子迁移得更少、速度更慢。天然凝胶电泳最常涉及两种类型的凝胶——琼脂糖和聚丙烯酰胺。琼脂糖是红藻细胞膜的衍生物，由多糖琼脂糖和琼脂胶组成，由于孔径较大，琼脂糖凝胶更适合于大于 200 千道尔顿的蛋白质样品。聚丙烯酰胺（聚 2-丙烯酰胺，是一种易于交联的神经毒素丙烯酰胺的聚合物。它的孔更细，虽然琼脂糖最常用于大多数情况下，但聚丙烯酰胺是较小样品质量的首选凝胶。
电泳涉及颗粒（如核酸或肽）在电场中由于电荷所受力的影响而通过介质的运动。电泳可以利用分子大小差异或电荷差异来分离相似的分子，并且分离量可以通过改变施加的电压或固定介质的密度来进行细化。SDS-PAGE 是一种用于根据大小分离蛋白质的技术，并且仅根据大小分离。十二烷基硫酸钠 (SDS) 是一种表面活性剂，在其序列中每 2 个氨基酸与蛋白质结合，并且由于 SDS 本身非常负电，它将分子的总电荷改变为负电荷。这种负电荷与蛋白质的质量成正比，因为与分子结合的 SDS 数量取决于存在多少个氨基酸双体。施加到蛋白质的负电荷远大于原始电荷，这使得不同蛋白质之间的电荷与质量比基本相同。当 SDS 与蛋白质结合时，它还通过使蛋白质变性和改变其键来使蛋白质构象改变为相似的形状。SDS 允许凝胶电泳根据蛋白质的分子量分离蛋白质，因为蛋白质之间的质量与电荷比相对一致。这是因为 SDS 凝胶具有筛分特性（根据颗粒的大小提供阻力）并且是统一的环境。它增加了微分迁移率。这些蛋白质的迁移率与其质量的对数成线性关系。利用这些信息，我们可以从它们的迁移率推断蛋白质的质量，甚至可以区分质量差异 2% 的蛋白质。因此，质量最大的分子，即与它们结合了更多 SDS 的分子，将在电场中比质量更小、与它们结合了更少 SDS 的分子下降得慢。这一原理与尺寸排阻（凝胶过滤）色谱相反，尺寸排阻色谱使较重的分子先出来，而较轻的分子后出来。
某些溶剂，如 PEG、甘油、乙醇和异丙醇，通过减少提供蛋白质水合球的自由水量来降低蛋白质的流体力学半径。极性溶剂将与水形成氢键，减少蛋白质周围的无序，从而减小水合球的尺寸。在这种情况下，蛋白质将在后期洗脱，就好像它们尺寸更小一样。
该过程完成后，蛋白质用染料染色，形成条带，代表每种蛋白质的迁移率层。随着每一步纯化过程的增加，电泳产生的条带越来越少，但一个单一的更深的条带，它代表着正在分离的蛋白质的浓度增加。
SDS-PAGE 和等电聚焦的分离技术可以结合使用，以允许进行 2DGE，它在蛋白质分离中采用更高的分辨率和灵敏度。这种强大技术的第一个维度是等电聚焦 (IEF)，第二个维度是聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)。在第一个维度中，蛋白质根据它们的等电点 (pI) 进行分离。为此，将凝胶涂抹到 SDS-聚丙烯酰胺板的顶部。然后，在水平方向上对凝胶施加电泳，蛋白质迁移到第二个维度凝胶中。然后再次施加电泳，这一次垂直穿过凝胶板，蛋白质将根据其分子量迁移。较重的蛋白质将移动更短的距离。相反，较轻的蛋白质将移动得更远。
虽然二维凝胶电泳是一种强大的技术，它呈现出更高的分离分辨率，但它也有一些局限性。2DGE 是一种耗时且劳动密集的过程，需要人工凝胶聚合、染色以及数小时的分离。此外，该技术并非没有风险。由于凝胶的加热可能会导致凝胶表面分子的翘曲和扩散，因此 2DGE 难以重现。
DNA 指纹识别是一种用于区分不同生物体的技术，方法是根据每个生物体的 DNA 配置之间的差异来区分。DNA 指纹识别通常由法医实验室使用，方法是将嫌疑人的 DNA 与在犯罪现场发现的 DNA 进行比较，以识别罪犯。来自嫌疑人的 DNA 通过凝胶电泳运行，并与在现场发现的 DNA 样本进行比较。如果两个样本在凝胶中产生相同的条带模式，那么可以确认嫌疑人在犯罪现场，因为没有两个人拥有完全相同的 DNA 模式。
为了进行指纹识别，必须从每个待评估的生物体中获取包含 DNA 的样本。DNA 样本的例子包括血液、尿液、唾液、皮肤或毛发。在分析样本之前，必须先对其进行制备。制备包括使用限制性内切酶将 DNA 分解成更小的片段。限制性内切酶是能够在特定核苷酸处切割 DNA 链的酶。这些核苷酸被称为限制性位点，通常标志着一个由 4 到 8 个核苷酸组成的序列的末端。每个限制性序列的成分和长度因人而异，因此使用限制性内切酶是将生物体的 DNA 分割成独特且特定片段的有效方法。此外，还会向凝胶中加入一定量的化学物质作为染料，这些染料在紫外线下会发光。这使得在分析样本蛋白质时更容易观察到条带。
包含许多不同短重复序列的 DNA 区域被称为微卫星。这些微卫星的长度因人而异，这使得它们成为限制性内切酶切割 DNA 的最佳位置。用限制性内切酶处理 DNA 样本后，DNA 就准备好了进行分析。将样本加载到凝胶板的孔中，并施加电流。较小的 DNA 片段在凝胶中移动得更快，因此会更靠近底部，而较大的片段会更靠近顶部。如果同时运行两个 DNA 样本，可以比较条带的位置。如果两个样本的条带模式相同，则意味着限制性内切酶在相同位置切割了每个样本的 DNA，表明两个 DNA 样本具有相同的核苷酸序列。相同的核苷酸序列表明两个样本来自同一个生物体。
指纹识别也是确定两个人是否相关的有用技术。虽然没有两个人拥有相同的 DNA 模式，但微卫星的某些部分会从父母传给孩子。并不是所有这些部分都会被遗传下来，但后代不会包含任何父母没有的模式。可以通过比较相关个体的指纹来进行亲子鉴定。如果在每个样本的指纹中重复出现大量模式组，则这些个体很可能存在亲缘关系。嵌入的图像包含三个不同的指纹，如三个不同的条带模式所示。虽然这些模式代表来自不同人的指纹，但样本 2 与样本 1 和 3 共享相似的模式，这表明样本 2 所代表的 DNA 的人很可能是样本 1 和 3 的孩子。
母系和父系 DNA 指纹测试用于确定两个人之间存在亲缘关系的可能性。这些测试不能给出明确的答案，而且并非万无一失。
凝胶中蛋白质的显像
[edit | edit source]由于大多数蛋白质在凝胶上肉眼不可见，因此必须采用一种方法来在电泳后对其进行显像。最常用的蛋白质染色剂是考马斯亮蓝。电泳后，将含有分离蛋白质的凝胶浸入染料的酸性酒精溶液中。这会使蛋白质变性，将其固定在凝胶中，防止其被洗掉，并允许染料与蛋白质结合。洗去多余的染料后，蛋白质会显示为离散的蓝色条带。使用考马斯亮蓝可以显像凝胶中低至 0.1-1.0 µg 的蛋白质。一种更灵敏的通用蛋白质染色方法包括将凝胶浸泡在银盐溶液中。然而，这种技术应用起来比较困难。如果蛋白质样本具有放射性，可以通过将凝胶覆盖一张 X 射线胶片来间接显像蛋白质。随着时间的推移（根据样本蛋白质的放射性，从几小时到几周不等），发射的辐射会使胶片变黑。在显影后，所得的放射自显影图将具有与放射性标记蛋白质位置相对应的暗区。另一种显像目标蛋白质的方法是在免疫印迹（Western blot）中使用针对该蛋白质的抗体。对于这种技术，蛋白质必须从凝胶中转移到硝基纤维素或尼龙膜上。这是通过将凝胶覆盖在硝基纤维素上实现的，然后硝基纤维素上会出现凝胶中模式的精确图像。然后用非特异性蛋白质溶液（例如牛奶粉）阻断硝基纤维素上多余的结合位点，然后再将其放入含有识别目标蛋白质的抗体（一抗）的溶液中。去除过量的未结合抗体后，现在特异性结合到目标蛋白质上的抗体可以用放射性标记、荧光或酶偶联的二抗进行检测。最后，通过将硝基纤维素放置在一张 X 射线胶片上（如果使用了放射性标记的二抗），使用荧光检测器，或者通过在硝基纤维素中加入能够被偶联到二抗上的酶转化为有色不溶性产物的底物溶液，来检测二抗。
参考文献
[edit | edit source]Hames, David. Hooper, Nigel. Biochemisty. 第三版. Taylor and Francis Group. 纽约. 2005.
http://www.sciencebuddies.org/science-fair-projects/project_ideas/BioChem_p009.shtml