结构生物化学/蛋白质/使用光谱法测量酶活性
酶是强大的生物学催化剂。催化剂可以加速反应，但不会在反应中消耗。因此，酶对于消化等身体功能至关重要，因为如果没有酶，这些反应将在身体无法承受的过高温度下进行。催化过程发生在活性位点。酶对它们的反应物或底物以及它们参与的化学反应类型具有极高的选择性。这是由于酶和底物之间形状、电荷和特征的相似性。将酶和底物结合在一起被称为酶-底物 (ES) 复合物。
通过实验分析观察到，酶促过渡态经常使用动力学同位素效应来理解反应物与过渡态中发现的中间体之间的键合差异。动力学同位素效应是指给定反应中两种不同同位素标记分子的反应速率之比。除了过渡态之外，酶在作为常见的药物靶标方面也发挥着重要作用，因为许多药物充当酶抑制剂。酶最常见的特征是它们能够催化反应并提高反应速率。它们还可以通过将较大的单个过渡态能垒分解并创建多个较小的能垒步骤来克服较大的单个过渡态能垒。反应速率还受到蛋白质中发生的构象变化以及反应物释放产生产物的速率的限制。此外，动力学同位素效应的值，通常是内在的，通常是反应态中原子键合环境与过渡态中发现的键合环境差异的结果。
确定酶活性的能力对临床化学极其重要，因为它可以早期诊断各种疾病，并帮助医生确定治疗这些疾病的方案。当酶和底物结合形成 ES 复合物时，它们的光谱特性会发生变化。为了测量酶表现出的这种活性，使用以下光谱技术：荧光光谱、紫外/可见光谱、分光光度法测定和红外光谱。
荧光光谱
荧光光谱揭示了 ES 复合物的存在及其组成。在荧光光谱中，化合物暴露于紫外光，这会激发某些分子并导致它们以较低的波长发射光，这通常是在可见光范围内。这种现象，即分子在一种波长下吸收光子导致同一分子在较长波长下发射另一个光子的现象，称为荧光。在这种光谱技术中，测量底物的荧光并将其与产物的荧光进行比较，在两种测量的差异中测量酶活性。
光消光测量的典型过程如下。在预定的时间间隔内，通过测量酶样品的光消光来收集 5-7 个测量点，其中在反应过程中消耗或产生光吸收物质。这可以使用光度计测量。然后找到这些测量点的平均值和标准差，并相对于时间作图。然后通过这些点绘制回归曲线。然后可以从特定时间点回归曲线的斜率找到酶活性。
许多荧光化合物中发现的杂质在暴露于光线下时会干扰光谱，使这种技术比其他测定法更敏感。
紫外-可见光谱
与荧光光谱互补的一种方法是紫外-可见光谱，因为荧光光谱处理从激发态到基态的跃迁，而紫外-可见光谱处理从基态到激发态的跃迁。紫外光谱使用紫外区域的光，在该区域分子最有可能发生电子跃迁。所谓电子跃迁是指当分子吸收紫外能量时，这会导致电子变得激发，这意味着它们迅速且不稳定地移动到更高的能级轨道。紫外光谱中使用的仪器是紫外/可见光分光光度计。该设备测量光通过样品的透射率。用于计算透射率的公式为 A=-log(%T)，其中 A 为吸光度，T 为 I/Io，其中 I 为通过样品的光强度，Io 为初始光强度，在它透射通过样品之前。一旦计算出吸光度，就可以将其相对于波长作图，得到紫外/可见光谱。
分光光度法测定
分光光度法测定可以通过测量测定吸收多少光来跟踪反应过程。当光在可见光区域 (400-750nm) 被吸收时，测定将实际上改变颜色。这被称为比色测定。比色测定的一个例子是 MTT。在 MTT 测定中，黄色 MTT(3-(4.5-二甲基噻唑-2-基)-2.5-二苯基四唑溴化物) 在细胞线粒体中还原为紫色甲臜，使反应呈现紫色，这可以进行酶的分析。使用某种溶液来溶解紫色的甲臜产物。然后使用分光光度计测量波长，通常在 500-600nm 之间。使用的溶剂决定了最大吸收波长。
紫外-可见光谱
紫外-可见光谱是一种常用的分光光度法测定，它检查紫外-可见光区域的光子。它主要用于确定特定溶液中高度共轭有机化合物或酶的含量。比尔-朗伯定律用于紫外-可见光谱来确定吸收光的物质的浓度。比尔-朗伯定律指出
A=-log10(I/I0)
该方程式显示了溶液浓度与溶液吸收之间直接成正比的关系，其中 A 是溶液的吸收，I 指的是它的浓度。
红外光谱
另一种可用于获取有关酶-底物复合物信息的光谱是红外光谱。在酶-底物复合物中，存在组织良好的结合模式，这可以使用红外方法进行量化。在分析红外数据时，可以识别 ES 复合物的结合模式和异质性。
需要探测器来实际测量在前面描述的过程中产生的酶活性。以下描述了行业中使用的典型探测器。
紫外/可见光探测器
紫外/可见光探测器是工业中最常用的探测器，因为它们用途广泛，具有很宽的动态范围，灵敏度高，并且不受温度和流量变化的影响。
固定波长探测器
固定波长探测器使用在特定波长下发射光的灯。为了选择特定波长，可以使用截止滤光片。固定波长探测器很好，因为它们不会产生很多噪声，运行成本不高，而且运行相对简单。
可变波长探测器
可变波长探测器与固定波长探测器不同，因为它们使用一系列波长，通常在 190-700 nm 之间连续，而不是一次只使用一个波长。对于可变波长探测器中的波长选择，使用连续可调单色仪。灯通常是氘灯或钨灯。来自灯的光线传播到镜子，镜子聚焦和引导光线进入衍射光栅，光栅驱动机构都是单色仪组件的一部分。为了监测不止一个波长，光栅在两个不同波长之间快速调整。
可变波长探测器的最新发展之一是二极管阵列探测器 (DAD)。DAD 通过将多个探测器并排放置在硅晶体上并使用电容器将光转换为电荷来加速整个过程。这使得来自光栅的光可以比传统分光光度计更快地被检测到。使用 DAD 相比于电机驱动单色仪的优势在于它们拥有更少的移动部件，并且在高速率下不太可能出现不规则数据。
荧光探测器
荧光检测器仅在化合物无法通过其他方法检测到且化合物必须具有荧光或可以通过与荧光化合物反应而具有荧光时使用。发射的光强度与激发辐射的功率成正比，因此荧光检测比吸收检测灵敏得多。通常，荧光检测器由光源、波长反射器和单流或双流池组成。
光源通常为氙灯、汞灯或石英卤素灯。波长反射器允许获取化合物的激发光谱。该信息可用于快速优化方法和验证分离质量。最后，单流和双流池分别考虑流动相的荧光。
折射率 (RI) 检测器
折射率 (RI) 检测器测量参考池和样品池中折射率的变化。该方法的缺点是化合物之间的折射率可能非常小，因此 RI 检测器的灵敏度远小于紫外/可见光和荧光检测器。使用 RI 检测器的另一个缺点是检测器响应受流动相组成的影响，这意味着最终收集的数据存在很多误差。RI 检测器有三种类型：偏转式、菲涅耳式和干涉式，但偏转式是最常用的。
在偏转式检测器中，光束穿过玻璃棱镜中的两个平行腔室，其中一个作为参考。如果溶液的折射率等于参考的折射率，则光束平行于入射光束。但是，如果折射率不同，则光束会偏转，然后由差分光电二极管测量。
电化学检测器
电化学检测器最常用于生物胺，因为它们比以前的方法更灵敏、更具选择性。电化学检测器有两种类型：整体性质和溶质性质。整体性质检测器最常用，它们测量电池电阻的变化。溶质性质检测器监测溶质通过电池时电势或电流的变化。溶质通过电极，电极保持恒定电压。产生的电流与溶质浓度成正比。
Bisswanger, Hans. Practical Enzymology. WILEY-VCH, 2004. 41-46.
Eisenthal, R., and M. J. Danson, eds. Enzyme Assays. Oxford UP, 2002. 119-23.
"Enzyme Assay." Wikipedia. 3 Oct. 2008. 21 Oct. 2008 <http://en.wikipedia.org/wiki/enzyme_assay>.
"Enzyme." Wikipedia. 23 Oct. 2008. 23 Oct. 2008 <http://en.wikipedia.org/wiki/enzyme>.
Kappe, Walter, Gotz-reinhard Lampe, and Harald Neuer. Method and apparatus for the determination of enzyme activity. Carl, Zeiss-stiftung, assignee. Patent 4055752. 1977.
Schramm, VL. "Enzymatic transition states, transition-state analogs, dynamics, thermodynamics. and lifetimes. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21675920