结构生物化学/蛋白质/纯化/毛细管电泳
毛细管电泳是一系列技术,它们使用狭窄的毛细管来执行大分子和小分子的高效分离。使用高压电源,溶液从阳极流向阴极,通过毛细管。通过这样做,溶液穿过检测器,并且根据分子的流动,积分器计算出分子从原始溶液中的分离。毛细管电泳有五种模式,包括毛细管区带电泳、等电聚焦、毛细管凝胶电泳、等速电泳和胶束电动毛细管色谱。
毛细管区带电泳是一种分离机制,它基于分子电荷与质量比的差异。缓冲溶液的均匀性以及恒定的电场强度是毛细管区带电泳过程的基础。它可以用于分离大型(DNA)和小分子(药物)。毛细管区带电泳是最简单的毛细管电泳形式。
等电聚焦是指将测试的溶液通过pH梯度,其中阳极处的pH低,阴极处的pH高。因此,当施加电压时,两性电解质混合物在毛细管中分离。
毛细管凝胶电泳在抗对流介质中进行,通常是聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶等。因此,介质的组成充当分子筛,用于尺寸分离。
在等速电泳中,异质缓冲液中没有电渗流。实际上,毛细管充满了导电电解质,其迁移率高于任何样品组分,以及终止电解质,其中电解质的离子迁移率低于任何样品组分。因此,溶液根据导电电解质和终止电解质分离。
在胶束电动毛细管色谱 (MECC 或 MEKC) 中,使用形成胶束的表面活性剂溶液可以产生类似于反相液相色谱的分离。基于疏水和静电相互作用,分析物在分子水平上进行组织。
与使用流体动力流动的HPLC相比,毛细管电泳基于电渗流 (EOF)。影响电渗流速率的因素有pH、电压、温度和缓冲液浓度。
在中性到碱性pH下,电渗流足够强于电泳迁移,以至于所有物质都被冲向负极。在高pH下,电渗流很大,肽带负电;尽管肽的电泳迁移向正极(阳极),但EOF很强,肽向负极(阴极)迁移。在低pH下,肽带正电,EOF非常小,因此导致肽电泳迁移和EOF向负极。但是,当缓冲液pH高于7.0时,大多数溶质无论带什么电荷都会向负极迁移。通常,选择的pH至少高于或低于分析物的pKa两个单位,以确保完全电离。
高电压通过减少分离时间来提供最佳效率。
在高温下,溶液的粘度降低,电渗流随之增加。但是,已知某些缓冲液对温度敏感,其pH值会发生变化。
当降低缓冲液浓度时,通过降低聚焦效应,结果的峰值效率会降低。
Wätzig, H.,Degenhardt, M. 和 Kunkel, A. (1998),毛细管电泳策略:药物和生物应用的方法开发和验证。 ELECTROPHORESIS, 19: 2695–2752。 doi: 10.1002/elps.1150191603