结构生物化学/蛋白质/纯化/差速离心

目的：你有一些细胞中的蛋白质，然后你想去除其他蛋白质，得到你想要的蛋白质。

一般信息

差速离心是一种根据质量分离细胞不同成分的方法。首先使用匀浆器破坏细胞膜，释放细胞成分。所得混合物称为匀浆液。将匀浆液离心以获得含有最致密细胞器的沉淀物。最致密的化合物将在较低的离心速度下形成沉淀物，而密度较低的化合物很可能保留在沉淀物上方的液体上清液中。每次离心，上清液都可以在更快的速度下离心以获得密度较低的细胞器。以逐步的方式进行离心，每次增加离心速度，可以根据质量分离成分。密度较高的细胞核最有可能在第一次离心步骤后出现，然后是线粒体，然后是更小的细胞器，最后是可能含有可溶性蛋白质的细胞质。

血液离心后的结果 - 化合物按重量分离。

平衡沉降使用溶液梯度根据每个粒子的密度（质量/体积）分离粒子。这种沉降的关键一点是它完全独立于分子的形状。它用于纯化差速离心。制备一种溶液，其梯度最致密的区域位于底部。然后将要分离的粒子添加到梯度中并离心。每个粒子继续前进，直到到达密度相似的环境。这种密度梯度可以是连续的，也可以以增量方式制备。例如，当使用蔗糖制备密度梯度时，可以将 40% 蔗糖溶液小心地漂浮到 45% 蔗糖层上，并在其上添加更少的密度层。然后将制备在稀释缓冲液中的匀浆液分层在顶部。离心后，通常在约 100,000 x g 下离心一个小时，可以观察到由于密度变化而驻留在从一层到另一层的细胞成分的圆盘。通过小心地调整层密度以匹配细胞类型，可以富集特定的细胞成分。

平衡沉降非常有用，因为它不会形成沉淀物。旋转速度会产生足够的力使蛋白质离开转子，但不会将其凝结成沉淀物。这是因为产生了蛋白质浓度梯度。扩散会对梯度产生反应，在一定时间后，沉降和扩散之间会达到完美的平衡。

平衡沉降在研究蛋白质之间的相互作用方面也很实用。特别是用于确定蛋白质的天然状态或天然构象。天然状态告诉我们蛋白质的三维结构。此信息包括它是单体、二聚体、三聚体、四聚体等。单体是只由一个亚基组成的蛋白质。二聚体是两个旋转 180 度的蛋白质亚基。三聚体是三个亚基等等。这种类型的实验也让我们可以确定蛋白质是否可以形成寡聚体（相同的肽链构成蛋白质的两个或多个单元）。此外，平衡沉降的使用在于它确定蛋白质-蛋白质和蛋白质-配体相互作用的平衡常数。这个 Kd 的值通常在 1nM-1mM 之间。这是通过测量平衡常数 (Kd) 计算得出的。最后，平衡沉降可以用来确定蛋白质复合物之间的化学计量比。这方面的例子是配体及其受体或抗原-抗体对。

参考文献

Durdik, Jeaninne。 "平衡沉降"。联盟蛋白实验室. 检索于 2009-10-10.