结构生物化学/蛋白质/纯化/埃德曼降解
埃德曼降解是指通过从肽的氨基末端依次去除一个残基来纯化蛋白质的过程。
为了解决水解条件下蛋白质损伤的问题，佩尔·埃德曼创建了一种新的标记和切割肽的方法。埃德曼想到了一种只去除一个残基的方法，这种方法不会破坏整个序列。这是通过添加苯异硫氰酸酯来实现的，它与 N 末端形成苯硫代氨基甲酰衍生物。然后在较温和的酸性条件下切割 N 末端，形成苯硫代腙 PTH-氨基酸的环状化合物。这不会破坏蛋白质，并留下肽的两个成分。这种方法可以重复进行，直到剩余的残基都分离出来，每次分离一个残基。
埃德曼降解非常有用，因为它不会破坏蛋白质。这使得蛋白质测序可以在更短的时间内完成。
另一种非传统的逐步测序多肽方法是使用苄基化学降解肽键。该过程主要分为三个步骤。首先，酰基叠氮化物在加入羟基苯时经历 Curtius 重排。Curtius 重排是一个两步过程，第一步是释放氮气形成酰基氮烯，然后酰基氮烯通过 R 基团的迁移以协同方式重排生成异氰酸酯。第二，在该过程中生成中间产物苄基氨基甲酸酯。最后，碳苄氧基分子作为保护基团被氢解裂解，最终生成伯酰胺和醛。总之，该过程需要苯甲酰化、转化为叠氮化物，以及用羟基苯处理叠氮化物；这种处理通过重排为异氰酸酯，生成碳苄氧基化合物，这些化合物需要氢化和氢解还原反应才能生成最终产物。
如果已知氨基酸的组成，则埃德曼测序的效果最好。为了确定氨基酸的组成，必须水解肽。这可以通过变性蛋白质并在长时间内加热并加入 HCl 来实现。这会导致单个氨基酸分离，并且可以使用离子交换色谱法分离它们。然后用茚三酮染色，可以通过光吸收量来确定氨基酸的量。这样，就可以确定组成，但不能确定顺序。
一种不太常用的测序氨基酸的方法是标记 N 末端。这可以通过使用丹磺酰氯来实现，它与胺基形成共价键，并且由于其荧光衍生物而可以被检测到。需要一个强的共价键，因为它需要在蛋白质水解时保持稳定。水解后，可以确定 N 末端；然而，这种方法并不实用，因为蛋白质会被水解条件破坏。这可能会导致测序丢失。
由于该方法的效率低于完美，因此无法通过埃德曼测序来测序更大的蛋白质。一种名为“分而治之”的策略成功地将更大的蛋白质切割成更小的、更实用的氨基酸。这是通过使用某种化学物质或酶来实现的，这种化学物质或酶可以切割特定氨基酸残基处的蛋白质。分离的肽可以通过色谱法分离。然后，由于它们的大小较小，可以使用埃德曼方法对它们进行测序。
为了将不同肽的所有序列拼凑起来，使用了一种重叠肽的方法。“分而治之”策略加上埃德曼测序再次使用，但使用不同的酶或化学物质将其切割成不同的残基。这使得可以获得同一蛋白质的两个不同氨基酸序列集，但位置不同。通过比较这两个序列并检查它们之间是否存在任何重叠，就可以确定原始蛋白质的序列。
例如，可以将胰蛋白酶用于初始肽，以将其在精氨酸和赖氨酸残基的羧基侧切割。使用胰蛋白酶切割蛋白质并使用埃德曼降解对其进行单独测序将产生许多不同的个体结果。尽管已知每个单独切割的氨基酸片段的序列，但顺序是混乱的。可以使用胰凝乳蛋白酶，它在芳香族和其他大体积非极性残基的羧基侧进行切割。这些片段的序列与胰蛋白酶片段的序列重叠。它们可以重叠以找到初始蛋白质的原始序列。然而，这种方法在分析更大尺寸的蛋白质（超过 100 个氨基酸）时受到限制，因为二级氢键干扰。其他弱的分子间键合，例如疏水相互作用，无法得到很好的预测。假设序列足够小，则只能正确预测蛋白质的线性序列。