结构生物化学/蛋白质/纯化/高效液相色谱
高效液相色谱（也称为高效液相色谱，或简称HPLC）是柱色谱的一种增强形式，通常用于生物化学中分离和纯化复合样品。与其他色谱方法中溶剂由于重力而滴落通过色谱柱不同，溶剂在高压下被推入色谱柱。
HPLC 的柱填料更均匀，并且更细致，因此有更多的相互作用机会，并具有更高的分离（分离）能力。由于柱由更高质量的材料制成，因此必须对色谱柱施加恒定压力才能获得可接受的流速。因此，最终结果是高分辨率和非常快的分离。
HPLC 在 1970 年代中期随着新柱技术的开发和改进而发展，取代了其他原始的柱色谱技术，这些技术在定量和纯化类似化合物时失败了。压力液相色谱法被证明比旧方法耗时更少。与经典的柱色谱法相比，经典的柱色谱法依靠重力驱动色谱柱，分离可能需要数小时甚至数天时间，而 HPLC 能够在五到三十分钟内完成。
到 1980 年代，HPLC 被广泛用于化合物纯化。计算机和其他改进的技术提高了 HPLC 的便利性。HPLC 中柱类型以及随之而来的重现性的改进，导致了微柱、亲和柱和快速 HPLC 的发展。
过去十年见证了微柱开发的巨大进步，微柱现在被广泛用于 HPLC 和其他专门色谱柱。典型的 HPLC 色谱柱的直径约为 3-5 毫米。但微柱或毛细管柱的典型直径范围为 3 µm 至 200 µm，因此要小得多。快速 HPLC 使用的色谱柱比典型色谱柱短，因此它们填充了更小的颗粒。
如今，人们可以选择多种类型的色谱柱用于分离混合物，以及各种检测器与 HPLC 配合使用，以获得最佳的化合物分析结果。
将一小部分样品放入高效液相色谱中，流动相将使其通过固定相。流动相通常是气体或液体，而固定相是固定且不溶的。固定相会因其物理或化学性质（尺寸、净电荷或其他差异，具体取决于 HPLC 类型）而减慢样品的流动速度，在此过程中样品将被过滤或纯化。由于固定相对杂质与所需化合物的影响不同，样品的不同组分将在不同的时间出来。组分从色谱柱中出来的时间称为保留时间。保留时间应该对特定样品中的组分是唯一的，因此分析的两个组分不会在同一时间洗脱并相互掩盖。如果溶剂组成无法调整以有效地分离 HPLC 分析中的组分，则其他类型的色谱可能更合适。与其他柱色谱技术不同，HPLC 使用泵施加压力将组分推过填充更细密的色谱柱，以加快分析速度，并能够分析在自身条件下洗脱时间更长的组分和色谱柱组合。
流动相是一种溶剂或混合溶剂，它将样品带过固定相。当流动相通过固定相时，样品组分与柱材料之间的分子相互作用决定了不同组分的保留时间。与色谱柱相比，与流动相具有更强相互作用的组分将“偏爱”流动相，并以更短的保留时间更快地洗脱，而与溶剂相比，与固定相具有更强相互作用的组分将“偏爱”色谱柱，并以更长的保留时间更慢地洗脱。这就是 HPLC 如何分离、过滤并帮助纯化化合物的原理。关于流动相，有不同的技术被调整以优化保留时间、分离和峰值清晰度。这些是等度、梯度和多型。
等度洗脱涉及恒定的流动相组成。例如，对于反相高效液相色谱（RP-HPLC）运行，流动相为 50% 乙腈和 50% 水，在整个分析过程中保持不变。选择一个溶剂系统，并在整个 HPLC 运行过程中使用它。样品在流动相流过时被注射，以恒定的流速进入 HPLC，并通过所选色谱柱。这种方法通常用于分析的样品足够简单，以至于样品的所有组分在不同的时间以足够的清晰度出来，并且没有过长的保留时间。
大多数样品并不那么容易处理。在这种情况下，将设置梯度洗脱方法。流动相混合物将在运行过程中发生变化，并且溶剂的浓度将被修改，以便运行从“较弱”的溶剂开始，而“较强”的溶剂将在结束时浓度最高。一个例子是反相高效液相色谱运行，它从更多流动相 A 开始，流动相 A 由 95% 水和 5% 乙腈混合而成，并将逐渐增加流动相 B，流动相 B 是 100% 乙腈混合物，直到运行结束时，流过色谱柱的大部分流动相都是流动相 B。通常对于反相高效液相色谱，流动相将从极性更强的溶剂组合开始，并在运行过程中增加极性更弱的溶剂组合的浓度。这样，非极性分子（相对于所使用的流动相和固定相）最终会由于非极性溶剂浓度较高而洗脱，并且分析所需的运行时间可以缩短。等度流动相的极性可能与固定相太接近，导致组分立即一起洗脱，并且它们的峰重叠，或者与非极性固定相的极性相差太大，导致非极性组分洗脱时间过长。这就是为什么梯度流动相经常用于分析的原因，其中可以修改非极性溶剂到极性更强的溶剂的浓度，以获得最佳的峰分离。
多型洗脱，也称为混合模式色谱，涉及使用一种特殊的色谱柱，该色谱柱可以根据溶剂切换分析模式。同一个色谱柱可以根据流过它的溶剂类型执行尺寸排阻、离子交换或亲和色谱。
保留时间取决于样品组分、流动相和固定相之间的相互作用。因此，设计良好的 HPLC 运行依赖于选择适合所需分析的色谱柱类型以及适合分析物和色谱柱的流动相组合。
色谱柱效率描述了固定相过滤或纯化的效果，基本上是它的填充程度以及物质在其上的移动效果。有几种方法可以衡量色谱柱效率，但它们都使用相同的公式
N=atr2/W2
N=理论塔板数
a=取决于图高度的常数
tr=保留时间
W=峰宽
正相色谱或NP-HPLC是第一种开发的 HPLC。在这种方法中，使用极性固定相和非极性流动相来分离基于极性的分析物。由于极性相是固定相，极性分析物将与该相结合。它们的吸附强度和洗脱时间取决于分析物极性和分析物空间因素的强度。由于洗脱时间取决于空间碰撞，因此可以区分和分离结构异构体，因为每个异构体具有不同的空间碰撞。可以通过在非极性流动相中添加非极性溶剂来增加洗脱时间。也可以通过在非极性流动相中添加极性物质，甚至占据固定相表面，阻止极性分析物与极性表面结合，从而减少分析物的保留时间。
过去，这种方法不受欢迎，因为水或质子有机溶剂会改变系统中介质的水合状态。然而，这个问题在NP-HPLC的另一种版本亲水相互作用液相色谱中得到了解决，该版本使用具有更好保留时间的多种相。
反相色谱顾名思义，与正相色谱相反，它具有非极性固定相和极性流动相。因此，非极性分析物将与非极性相结合，其洗脱时间也将取决于其非极性程度。也可以通过在流动相中添加极性溶剂来增加洗脱时间，或者通过在同一相中添加非极性溶剂来减少洗脱时间。然而，与 NP-HPLC 不同，该方法依赖于疏水相互作用。
一些因素会影响疏水相互作用。其中一个因素是表面积。具有较大疏水表面积的分析物将具有更长的保留时间，因为分析物与非极性表面之间会有更多键相互作用。然而，过大的分析物表面将无法进入非极性相的孔隙，并且不会与该相发生任何相互作用。这种键强度的增强也是由于水对分析物周围的“空腔减少”力的作用，在这个过程中释放的能量取决于洗脱液的表面张力，在本例中是水。
另一个可能影响疏水相互作用的因素是 pH 值。理想的环境是不带电荷的环境。因此，化学家使用缓冲剂（如磷酸钠）来调节 pH 值并中和固定相上通常由二氧化硅组成的暴露介质上的电荷以及分析物上的电荷。
反相色谱柱比普通二氧化硅色谱柱更强，但仍有一些缺点。碱性水溶液不应与由烷基衍化的二氧化硅颗粒组成的色谱柱一起使用，因为碱性将破坏下面的二氧化硅颗粒。此外，如果使用含水酸，则应避免长时间暴露在色谱柱上，以防止腐蚀。
凝胶过滤色谱根据蛋白质大小的不同进行分离。该过程涉及将装满缓冲液的凝胶装入色谱柱中。该凝胶具有许多多孔的碳水化合物聚合物珠状颗粒。孔的大小选择使得它只能允许特定尺寸的蛋白质扩散通过。那些足够小可以进入珠子孔隙的分子，由于被迫进入色谱柱的固定相，因此它们的移动速度会变慢。另一方面，较大的分子由于无法进入珠子的内部体积，最终会更快地穿过色谱柱。
凝胶过滤色谱最重要的优点是它能够以原始的非变性状态分离蛋白质，为您提供适合进一步分析的样品。另一个优点是在色谱柱中施加压力以获得足够的流速，从而获得高分辨率。更慢的流速可以实现更高的分辨率。对于大多数凝胶，推荐的蛋白质分离最佳流速约为 5mL/cm2/h。
参考文献：Aguilar，Marie-Isabel。肽和蛋白质的 HPLC 方法和协议。第 251 卷。Humana Press。
离子交换色谱根据蛋白质的电荷进行分离。它足够有效，可以分离仅在单个带电基团上不同的蛋白质。它取决于蛋白质上的带电基团与色谱柱中带有相反电荷的离子交换凝胶之间形成离子键。不带电荷的中性蛋白质通过洗涤去除。然而，那些可以形成离子键的蛋白质通过使用更高离子强度的缓冲液或改变 pH 值进行洗脱来回收。相反电荷离子（被分析蛋白质的离子与凝胶介质的离子）的增加会增加保留时间，这基于蛋白质离子与凝胶介质中带电离子之间的吸引力。
离子交换剂有两种类型。一种是阴离子交换剂，它在凝胶介质中具有正电荷基团，这些基团是固定的，并且会与蛋白质中的负电荷离子相互作用并结合。另一种是阳离子交换剂，它在凝胶介质中也具有负电荷基团，但会与蛋白质中的正电荷离子相互作用并结合。
溶液的 pH 值也会改变蛋白质离子与凝胶介质中离子之间的电离过程。当 pH 值等于蛋白质的等电点（净电荷为零的点）时。然而，当 pH 值小于等电点时，蛋白质上的净电荷将为正，并且它将与阳离子交换剂结合。最后，如果 pH 值大于等电点，蛋白质上的净电荷将为负，并且它将与阴离子交换剂结合。因此，通过控制溶液的 pH 值，我们可以控制蛋白质的分离方式，因为正是这些交换剂分离了蛋白质。
参考文献：Aguilar，Marie-Isabel。肽和蛋白质的 HPLC 方法和协议。第 251 卷。Humana Press。
亲和色谱是一种分离生物化学混合物的方法，基于高度特异的生物相互作用。它用于从混合物中纯化分子并将其浓缩到缓冲溶液中，以及识别哪些生物化合物与其他分子（如药物）结合。它是由 Pedro Cuatrecasas 和 Meir Wilcheck 在 1968 年发现的。
该过程涉及将要从混合物中分离的目标蛋白质（或分子）捕获到固体或介质上。色谱柱中装满了含有共价葡萄糖残基的珠子，选择这些残基与目标蛋白质相对应。蛋白质在倒入色谱柱时会穿过珠子，当识别出目标蛋白质时，它会由于对葡萄糖的亲和力而通过共价键被捕获到色谱柱上。其余蛋白质将流出色谱柱并成功分离。将一部分缓冲液添加到色谱柱中以洗掉未结合的蛋白质。最后，添加浓缩的葡萄糖溶液以将目标蛋白质从与色谱柱连接的葡萄糖残基中分离出来，从而使蛋白质完全从混合物中纯化出来。
吸附色谱
吸附是指溶质在固体或液体表面积累的现象。色谱法利用溶质极性差异进行分离混合溶质。其原理是极性溶质与极性固定相形成更强的键合，而非极性溶质则形成较弱的键合。将不溶性极性物质，如硅胶（二氧化硅的衍生物，Si(OH)¬4），填充到玻璃柱中，形成固定相。样品中包含的混合物是流动相，可以是液体或气体，将其倒入玻璃柱中，不同极性的溶质将在柱中与固定相以不同的方式结合。极性溶质将牢固地结合到固定相，而非极性溶质将结合得更松散，中性溶质将直接通过柱体。溶质可以用极性逐渐升高的溶剂洗脱，洗脱顺序与极性增加一致。因此，中性溶质将直接通过柱体，而非极性溶质将首先洗脱，而极性溶质将最后洗脱。
参考文献：生物化学原理 第4版. Nelson, David L.; Cox,Michael M.W.H Freeman and Company. New York
- 实用高效液相色谱法开发 第2版. Snyder, Lloyd R.; Kirkland, Joseph Jack; Glajch, Joseph L. New York.
- 高效液相色谱法药物分析手册. M. W. Dong. Elsevier.