结构生物化学/蛋白质/纯化/TEST
如果已知氨基酸的组成，则 Edman 测序的效果最佳。要确定氨基酸的组成，必须水解肽。这可以通过将蛋白质变性为其组成部分来完成，将其加热到 110 ˚C 并添加 6 M HCl 24 小时。然后可以通过离子交换色谱法分离氨基酸。蛋白质中的每种氨基酸都可以通过其洗脱水平来识别，即为了去除氨基酸而添加的缓冲液量。. 还添加了茚三酮或荧光胺指示剂染料到柱中，可以通过比较每种氨基酸显示的颜色强度水平来识别蛋白质中每种氨基酸的量。这样，就可以确定组成，但不能确定序列。
一种不太实用的氨基酸测序方法是标记 N 末端。这可以通过使用丹磺酰氯来完成，丹磺酰氯与胺基形成共价键，并且由于其荧光衍生物而可以被检测到。需要一个牢固的共价键，因为它需要在蛋白质被水解时保持稳定。水解后，可以确定 N 末端；但是，这种方法不太实用，因为蛋白质会被水解条件破坏。这可能导致测序丢失。
为了解决水解条件损坏蛋白质的问题，Pehr Edman 创建了一种新的肽标记和切割方法。Edman 想出了一种方法，可以一次只去除一个残基，而不会破坏整体测序。这是通过添加苯异硫氰酸酯来完成的，苯异硫氰酸酯会与未带电荷的末端基团反应，并与 N 末端形成苯硫代氨基甲酰衍生物。然后在较温和的酸性条件下切割 N 末端，形成苯硫代乙内酰胺 PTH-氨基酸的环状化合物。然后可以使用色谱法来鉴定环状化合物中的氨基酸。这不会破坏蛋白质，并且至少会留下肽的两个组成部分。这种方法可以重复用于剩余的残基。
较大的蛋白质（包含 50 多个残基的蛋白质）无法通过 Edman 测序来测序，因为肽在反应的每个步骤中不再释放单个氨基酸。随着从链中去除更多氨基酸，该过程变得效率降低，它们变得越来越不纯。一种称为“分而治之”的策略成功地将较大的蛋白质切割成更小的、实用的氨基酸。这是通过使用某些化学物质或酶（氰化溴或蛋白水解酶）来完成的，这些物质或酶可以在特定的氨基酸残基处切割蛋白质。这种切割方法在链的预测区域打破氨基酸残基，因此在最后更容易确定其整体序列 -*分离的肽可以通过色谱法分离。然后，由于它们的尺寸较小，可以使用 Edman 方法对它们进行测序。
为了将不同肽的所有序列组合在一起，使用了一种重叠肽的方法。再次使用“分而治之”和 Edman 测序策略，但使用不同的酶或化学物质将其切割成不同的残基。这允许分离同一蛋白质的两个不同氨基酸序列集，但在不同的点。通过比较这两个序列并检查两者之间是否有任何重叠，可以知道原始蛋白质的序列。有时，原始蛋白质链实际上是几个不同的蛋白质链，使用 SDS-凝胶电泳来计数 N 末端氨基酸以确定原始链的数量。然后，使用尿素或盐酸胍来变性保持在一起的几个多肽链，然后使用上述鉴定程序确定其各自的序列。