结构生物化学/蛋白质/纯化/PFK-1 纯化的微型化
我们正在从常规纯化转向微型纯化，微型纯化的体积是标准纯化的百分之一，科学家们转向微型纯化的原因有很多。一个主要原因是生物化学家最终希望研究癌细胞。然而，他们预计提供的癌细胞将很小。因此，修改现有纯化方法（常规纯化）以实现微型纯化（体积为百分之一）至关重要。
另一个原因是生物化学家将找到适合蛋白质体积的 DEAE Sephacel 颗粒容量，这意味着他们将用蛋白质饱和颗粒以找到最大容量。
背景信息
蛋白质的标准纯化被认为是生物化学技术中比较老式的技术，其中蛋白质根据其大小、电荷、溶解度、官能团等特性进行分离。在常规纯化中，生物化学家通常从蛋白质源开始，并使用不同的分离组合技术，根据蛋白质的特性，例如离心和电泳，对蛋白质进行区分。微型纯化与标准纯化类似，但生物化学家修改了标准纯化的规模。例如，在 DEAE 中，生物化学家可以使用 0.1 毫升的 DEAE-Sephacel 离子交换柱，而不是使用 50-60 毫升的柱子。一般来说，微型纯化中采用的大多数技术的规模都进行了微型化。
方法和材料
研究人员在多种蛋白质中使用了微型纯化技术，但我们将重点关注磷酸果糖激酶-1（PFK-1）的微型纯化，PFK-1 是一种调节糖酵解过程的蛋白质。第一步通常是从来源获取蛋白质，在本例中，来源是兔肌肉组织。然后，将肌肉组织混合并匀浆。但是，为了防止蛋白质分解，生物化学家通常使用充当蛋白酶抑制剂的化学物质，以保护蛋白质在匀浆过程中不被分解。然后将匀浆液进行平衡。
离心步骤紧随匀浆步骤。在这一步，生物化学家通常根据密度分离上清液和沉淀物。PFK-1 是一种可溶性蛋白，因此我们预计它存在于上清液中。因此，我们可以直接丢弃上清液。此时，除了我们的蛋白质外，上清液中还有很多其他物质。
就像标准纯化一样，下一步将被称为加热步骤。当固体物质重新悬浮时，会进行热变性。这一步的目的是变性溶液中所有除目标蛋白质以外的其他蛋白质。这可以通过使用包含底物 MgSO4 和 ATP 的溶液来完成，这些溶液可以稳定 rPFK-1，使其免于变性。然后，我们将上清液和沉淀物分离，我们预计我们的蛋白质存在于上清液中。
亲和色谱技术用于根据蛋白质的电荷分离蛋白质。在加热步骤之后，按照标准纯化程序设置 1 毫升微型纯化柱，使用 1/10 体积的 DEAE（离子交换）颗粒来分离酶。由于我们的蛋白质带正电荷，而颗粒带负电荷，因此我们的蛋白质会粘附在颗粒上。之后，添加不同浓度的小部分弱碱。最后，我们将蛋白质与多个组分一起获得。
最后，如果由于任何原因，纯化不能在一天内完成，则需要进行额外的盐析步骤来沉淀酶。由颗粒组成的 G-25 Sephadex 脱盐柱通过大小分离酶和 NH4SO4。理想情况下，收集的前几个组分预计将含有最大量的 PF Works Cited Russell, P.J. "Inhibition of rabbit muscle isozymes by vitamin C." the Harwood Academic Publishers imprin 15 (2000): 283-296.
K-1 活性，其中 NH4SO4 的含量最少。为了检查蛋白质的纯度，生物化学家使用 SDS-PAGE。在此步骤中，我们能够识别我们的酶的纯度及其分子量（以道尔顿为单位）。参考（Russell）Works Cited Russell, P.J. "Inhibition of rabbit muscle isozymes by vitamin C." the Harwood Academic Publishers imprin 15 (2000): 283-296.
, A. Williams，以及 T.A. Austin，（2000）J. Enzyme Inhibition，第 15 卷，283-296 页。
P.J. Russell, A. Williams and D. Gapuz (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun., 233, 386-388.