结构生物化学/蛋白质/蛋白质印迹
蛋白质印迹是另一种利用抗体来检测样本中特定蛋白质的存在的技术。它能够检测细胞或体液中少量的蛋白质。蛋白质印迹能够从混合物中找到蛋白质。
蛋白质印迹起源于斯坦福大学乔治·斯塔克的实验室，是一种通过特定抗体染色来检测特定蛋白质的技术。它的分析可以告诉我们蛋白质的大小或细胞中积累了多少蛋白质。但这并不意味着它可以用于任何蛋白质，因为如果蛋白质快速降解，就很难检测到它。这项技术中重要的是抗体，因为蛋白质印迹基于使用“高质量”抗体作为探针来检测特定蛋白质。在这个技术中，我们首先使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离蛋白质，该电泳基于蛋白质的大小。然后，将凝胶上的这些蛋白质通过印迹转移到聚合物片材的表面。一旦我们将针对所需蛋白质的特异性抗体添加到片材中，它就会与该蛋白质结合，因为它们没有其他东西可以结合。然后，我们将未结合的一抗洗掉，这种蛋白质-一抗可以通过二抗检测。这些二抗只能识别一抗，其中许多二抗与一个一抗结合并发出信号，即二抗上的放射性标记在X射线片上产生一条深色条带。
- 样品进行SDS PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳），其中SDS去污剂附着在蛋白质上，使其相对于大小带负电荷，从而使蛋白质迁移到带正电荷的阴极。较大的蛋白质通过丙烯酰胺凝胶基质移动速度较慢，而较小的蛋白质移动速度较快，从而形成基于基质中迁移速度和随后大小的不同梯度条带。
- 产生的蛋白质条带被转移到与蛋白质结合的聚合物片材（硝酸纤维素滤膜或聚偏氟乙烯，PVDF）上。这使得蛋白质能够与抗体结合。
- 由于聚合物片材结合所有蛋白质，因此片材上剩余的空白空间必须被封闭，以防止它与抗体反应。这是通过将聚合物片材在脱脂奶粉中洗涤来完成的，脱脂奶粉含有酪蛋白（一种蛋白质），这将覆盖片材的其余部分。
- 然后将片材与针对目标蛋白质的一抗孵育。在洗涤和稀释后，将片材再次与二抗孵育，二抗与一抗结合。通常，这种二抗是荧光或放射性标记的。将片材再次洗涤并稀释。
- 将片材与酶底物孵育，该底物将使二抗发出光。照相底片将检测到这种光，显示为深色条带。放射性标记的抗体通过X射线片检测。
影响转移的因素
缓冲液
一种常用的转移缓冲液是Tris-甘氨酸，其pH值为8.3，含有低浓度的SDS和20%甲醇。甘氨酸代替Cl，因为它具有较低的电荷密度，而电流越低，产生的热量就越少。在这个pH值下，许多蛋白质将带轻微的负电荷，这将使蛋白质更容易转移，因为它们将倾向于向带正电荷的电极移动。SDS有利于从凝胶中洗脱，因为它覆盖了带负电荷的蛋白质。但是，如果蛋白质带的负电荷过多，疏水性膜将排斥蛋白质，因此蛋白质不太可能转移到膜上。为了防止这种情况，将使用甲醇从蛋白质中去除SDS，SDS覆盖了蛋白质上的疏水位点，然后这些疏水位点可以与膜结合。如果没有甲醇，则有利于从凝胶中洗脱，但膜上的结合效果不佳。如果甲醇过多，则在蛋白质离开凝胶之前SDS可能会全部脱落，而暴露的疏水区域可能会聚集形成大型蛋白质聚集体，这些聚集体将被困在凝胶中，因此无法转移出来。
膜
有不同类型具有不同孔径的膜。最常用的膜的孔径约为0.45微米，但对于有效捕获尺寸小于20kDa的蛋白质，需要更小的孔径。
转移过程中的电压
电流比电压更重要。这里的一个因素是加热。第二个因素是，如果电流过高，低分子量蛋白质会很快穿过膜，以至于它们没有机会与膜结合。
转移时间
蛋白质的迁移将取决于其大小。蛋白质尺寸越大，迁移所需的时间越长。有时，会在凝胶旁边放置两层膜，以捕获可能穿过第一层膜的较小蛋白质。
蛋白质电荷
如果蛋白质在去除SDS后带正电荷，那么它们将难以转移。因为它们的等电点可能与缓冲液体系的pH值相似。因此，蛋白质不会向正极迁移，也不会转移到膜上。我们可以通过将缓冲液体系的pH值提高到更高的值来解决这个问题。
•蛋白质印迹是一种有效且有用的方法，可以检测和表征少量的蛋白质，例如时钟蛋白。此外，还可以使用蛋白质印迹来查找时钟蛋白的其他特性，如半衰期、摩尔量。
•这项技术可以很容易地检测到来自感染性病原体（例如病毒、细菌）的免疫反应。
•蛋白质印迹不仅利用抗原，还利用抗血清作为诊断工具。抗血清广泛用于检测HIV的存在。
•与ELISA相比，蛋白质印迹具有更高的特异性；特异性越高，方法对抗体特异性的依赖性就越小。
•聚偏氟乙烯（PVDF）或尼龙通常用作蛋白质印迹中的膜，因为它具有高蛋白质结合能力和化学稳定性。甚至，一些蛋白质组只与尼龙结合或强烈地偏向于尼龙。
•在三种常见的酶底物中，荧光和化学发光产生可通过X射线或扫描仪检测到的光。这种能力使高灵敏度和更快的处理时间成为可能。
•非目标蛋白质有轻微的几率与二抗反应，导致错误蛋白质的标记。
•蛋白质的意外磷酸化或氧化可能会导致样品处理后出现多个条带。
•当将样品从凝胶/膜夹层中转移时，可能会出现气泡，也可能在用抗体孵育样品时出现气泡，从而导致条带读数出现偏差。
•如果将蛋白质转移到膜上的转移时间不够，则分子量较大的蛋白质将无法正确转移，导致错误的条带读数或根本没有条带读数。
•转移缓冲液中的甲醇过多会降低蛋白质从凝胶转移到膜的效率；但是甲醇有助于蛋白质与几种不同的膜结合，因此需要正确的平衡。
•蛋白质印迹是一个非常微妙的过程，需要每个组分的正确量才能成功识别蛋白质的存在。程序中任何步骤的不平衡都可能使整个过程出现偏差。
远端蛋白质印迹基于蛋白质印迹技术。主要区别在于远端蛋白质印迹使用非抗体蛋白质，这些蛋白质可以与目标蛋白质结合。远端蛋白质印迹用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。
东方印迹法是西方印迹法的扩展，用于检测蛋白质翻译后修饰。东方印迹法用于检测脂酰化、糖基化或磷酸化蛋白质，或其他翻译后修饰的蛋白质。印迹主要是在 SDS-PAGE 凝胶上进行，然后转移到 PVDF 或硝酸纤维素膜上。通过特异性探针检测翻译后蛋白质修饰，包括磷酸化、脂酰化、糖基化或任何其他蛋白质修饰。
分析由高效薄层色谱 (HPTLC) 分离的条带。进一步的分析是通过将 HPTLC 板转移到 PVDF 膜上，然后进行酶或配体测定或质谱分析来进行。该方法的缺点是，由于色谱和西方印迹都需要单独进行后实验读取，因此在连续准备两者时存在较长的停机时间。
远东印迹法允许以下技术：■ 糖鞘脂和磷脂的纯化。■ 与直接质谱联用的脂质结构分析。■ 使用各种配体（如抗体、凝集素、细菌、病毒和毒素）进行结合研究，以及 ■ 膜上的酶反应。
• 此外，重要的是要知道，在大多数情况下，印迹是硝酸纤维素或聚偏氟乙烯膜，当浸入凝胶并施加电流时，它是可移动的。为了使蛋白质沿着凝胶移动，蛋白质必须是可溶的。需要裂解缓冲液来完成此操作。（参考：www.abscam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。
• 西方印迹法用于人类免疫缺陷病毒 (HIV) 检测。印迹用于检测人血样中的抗 HIV 抗体。被 HIV 感染的细胞的蛋白质被分离并在膜上印迹。然后将人血样用于抗体孵育步骤，并将游离抗体洗去，然后加入第二抗人抗体。在 X 射线分析后，染色条带显示该人血液中包含抗体的蛋白质。
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