结构生物化学/p73
p73 是 p53 家族的 转录 因子的一部分，该家族还包括 p63。该家族以其调节细胞周期停滞和 凋亡 的能力而闻名。p73 和 p63 在结构和功能上都与 p53 相似，据信它们也是 肿瘤抑制蛋白[1]。p73 的单体与 p53 有 50% 的同源性，导致两种蛋白的折叠非常相似。[2] 尽管这两种蛋白具有非常相似的结构和功能，但 50% 的癌症具有突变的 p53 蛋白，而只有 0.5% 的癌症具有突变的 p73 蛋白，这对科学家来说非常有趣。[2]
p73 蛋白具有与 p53 非常相似的 DNA 结构域结构。p73 蛋白比 p53 蛋白更大，因为它具有 636 个氨基酸序列。[2] 与 p53 相似，它有三个结构域，包括一个转录激活域 (TA)，该域是 p73 N 末端之后的富含脯氨酸的序列，一个中央 DNA 结合域 (DBD) 和一个具有寡聚化域 (OD) 的 C 末端。[3] 由于它们属于同一个蛋白家族，p73 与 p53 共享 50% 的序列同源性，尤其是在 DBD 中。[2] 序列的相似性导致了相似的折叠结构，这使得 p73 能够以与 p53 非常相似的方式发挥作用，例如识别和调节 p53 蛋白的靶标。[2] 然而，寡聚化域在这两种蛋白之间不太保守。在该区域，p73 与 p63 更相似，因为它可以与 p63 异寡聚化，但不能与 p53 异寡聚化。[1]
p73 存在多种亚型。有一些亚型拥有与 p53 上的位点相似的转录激活位点，并用 TAp73 表示。其他亚型是 ΔNp73，这些亚型最初来自 TAp73 启动子转录，由于异常剪接而不具有 N 端转录激活域。[4] 研究表明，小鼠 TAp73 的敲除使小鼠更容易受到致癌物质的影响，因此更容易发生肿瘤。然而，体内敲除 ΔNp73 实际上减少了肿瘤生长，表明基因的两种不同亚型会导致不同的结果。[4]
p53 家族蛋白在不同的途径中发挥作用，但它们确实有一些重叠的功能。[2]
- MDM2 降解 p53 和 p73。
- p53 和 p73 都在触发凋亡中发挥作用
然而，研究表明，只有 p53 被敲除的细胞与 p53 和 p73 都被敲除的细胞具有不同的化疗敏感性。[5] 在化疗中，患者会接受靶向快速生长的细胞并杀死它们的药物。癌细胞繁殖速度非常快，因此更容易成为这些药物的靶标，但是其他快速生长的细胞，如头发和胃壁，也可能是这些药物的靶标。在一些体内和体外研究中，已经观察到，突变的 p53 实际上能够与 p73 结合并使该蛋白失活，导致细胞对化疗更具耐受性。[5]
TAp73 可以在 G1 和 G2 期停止细胞周期。在 G1 期，TAp73 通过 p21 和 p57/Kip2 的转录上调来阻止细胞周期，p21 和 p57/Kip2 是阻止细胞周期继续的蛋白质。[3] 在 G2 期，p73 抑制 G2/M 调节剂，包括 CDC25B、CDC25C、Cyclin B1、Cyclin B2、cdc 2 和 Topoisimerase IIα，从而阻止细胞离开间期并进入 有丝分裂。[3] 即使在有丝分裂中，当 p73 被推测为高度磷酸化且非常不活跃时，它仍然发挥作用，因为它可以转录 p57/Kip2 基因，这些基因是细胞增殖的负调节因子。[3] 已经证明，TAp73 与纺锤体组装检查点相互作用，并有助于该活动，并且据信该点处的故障是肿瘤发生的原因。[3][4]
TAp73 还可以通过多种机制发出细胞死亡信号。通过线粒体途径，TAp73 能够上调 Bax 并促进其移动到 线粒体，这发生在 Bax 接受凋亡信号时。[3] 通过内质网应激途径，p73 上调 scrotin，scrotin 是一种可以在 ER 以及超基底角质形成细胞中诱导凋亡的基因。[3]。它还可以调节死亡受体途径并诱导 CD95 表达（一种死亡受体）。[3]
这种 p73 的亚型被认为是 TAp73 和 p53 的负调节因子，因为它抑制了生长抑制和细胞凋亡。ΔNp73 通过形成无活性的寡聚体来抑制 TAp73 的转录活性，并与 p53 竞争 DNA 结合位点。[3] 研究表明，在癌症细胞中，ΔNp73 的减少会导致细胞凋亡。[4] 然而，当 TAp73 和 p53 被激活时，会发生一个反馈环路途径，该途径会诱导 ΔNp73，形成一个自调节反馈环路，从而保证不会有太多活性的 TAp73 和 p53 分子。研究还表明，如果检测到 DNA 损伤，就会触发 ΔNp73 的降解，从而使 TAp73 能够发挥作用。[3]
增加 TAp73 数量和减少 ΔNp73 数量的一种可能方法是控制 TAp73 启动子转录本的剪接。在肝细胞癌细胞中，导致转录本从 TAp73 转变为 ΔNp73 的异常剪接是由剪接因子 Slu7 的耗竭引起的。Slu7 的耗竭是由 c-Jun N 末端激酶 1 (JNK-1) 活性引起的，而 JNK-1 活性又是由 AR 激活 EGFR 引起的。[4] 另一种增加 TAp73/ΔNp73 比例以有利于 TAp73 的方法是使用 COX-2 抑制剂塞来昔布，研究表明塞来昔布可以增加神经母细胞瘤细胞中的 TAp73β。[4]
p73 的调控
[edit | edit source]在大多数实体瘤中，实际上 p73 的含量丰富，但它无法发挥任何抗肿瘤活性，因为它被各种抑制剂所阻断，这些抑制剂包括家族蛋白（如 ΔNp73、ΔNp63、突变的 p53）和非家族蛋白（如 MDM2、iASPP 或 mTOR）。[4] 由于 p73 的功能众多且复杂，因此在它被转录后，通过改变蛋白质的稳定性或位置以及蛋白质与启动子结合的能力来对其进行调控。p73 通过泛素化系统降解来进行调控。[3] MDM2 负责降解 p53 蛋白，它也可以与 p73 结合。然而，它不会降解蛋白质，而是将其转移到核斑点并改变其转录活性。E3 泛素连接酶 ITCH 与 p73 结合，在正常情况下促进蛋白质降解。在压力情况下，ITCH 被下调，p73 和 p63 的水平会升高。与 MDM2 不同，ITCH 只针对 p63 和 p73。[3] 其他可以调节 p73 的基因包括：PIAS1，它使 p73 发生 SUMO 化，从而降低 p73 的转录活性，并使细胞退出细胞周期的 G1 期。当 Cyclyn/CDK 复合物对 p73 进行苏氨酸磷酸化时，p73 的转录活性也会降低。SIRT1 抑制 p73 的乙酰化，从而降低 p73 的活性。[3]
实验
[edit | edit source]调控 DNA 损伤修复 [6]
[edit | edit source]当正常细胞暴露于胆汁酸时，p73 的作用在应对 DNA 损伤时被激活。胆汁酸暴露导致的 DNA 损伤增加仅触发了 p73 的反应；这一结果表明 p73 的诱导独立于 p53 和 p63，但依赖于 c-Abl 激酶的选择性激活。p73 的诱导激活了两种糖基化酶 SMUG1 和 MUTYH 的转录，以进行碱基切除修复。当 p73 缺乏时，会明显出现 DNA 损伤增加[6]。
食管腺癌的发生涉及胃食管反流病的严重进展，胃液与胆汁酸混合并进入食管。食管暴露于胃酸和胆汁酸会导致炎症和组织损伤。此外，胆汁和酸的反流会导致基因毒性压力，这会增加 ROS 和 RNS 的产生，并最终导致 DNA 氧化损伤。
方法[6]。
[edit | edit source]细胞培养、转染、逆转录病毒感染和 BA 处理
在 DMEM 中培养初级胎儿食管成纤维细胞、人非肿瘤性食管上皮细胞系和 p53 缺失的食管腺癌细胞系。在含有牛垂体提取物和表皮生长因子的 KSFM 培养基中培养 hTERT 永生化的食管上皮 EPC2 细胞。然后使用带有 shRNA 的慢病毒转导或 RNA 转染来抑制 P73，这两种方法都针对所有亚型中发现的特异性序列。
抗体、免疫沉淀和免疫荧光
抗体用于以下各种蛋白质：p73、p63、c-Abl、磷酸化 c-Abl、磷酸化 p53、β-肌动蛋白、磷酸化组蛋白 H2A.X、磷酸化酪氨酸、8-氧鸟嘌呤、p53、p21、PUMA、SMUG1、MUTYH 和非特异性兔 IgG。使用抗 p73 抗体进行免疫沉淀，并使用蛋白质印迹法分析 p73 的酪氨酸磷酸化。进行免疫荧光时，将细胞在腔室侧培养至 50% 汇合。对磷酸化组蛋白和 8-氧鸟嘌呤进行染色，并测量荧光信号的强度。
实时 PCR 和染色质免疫沉淀
分离 RNA，使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒逆转录总 RNA，并使用实时 PCR。对 p73 抗体进行染色质免疫沉淀，非特异性兔 IgG 用作 HET-1A 细胞的阴性对照。然后分析 p73 结合位点。使用特定序列的引物来分析 p73、MUTYH、SMUG1 mRNA 水平和 ChIP。
PCR 阵列、彗星和磨损部位量化分析
彗星分析是根据协议进行修改的。将细胞与低熔点琼脂糖混合并涂抹到预涂有琼脂糖的载玻片上。使用缓冲液诱导细胞裂解，然后在碱性条件下进行电泳。然后对载玻片进行染色，使用 CometScore 软件进行分析。比较和分析了 p73 缺陷和 HET-1A 细胞中的 mRNA 表达。
手术程序和免疫组织化学
分析了携带野生型 p73 和正常 p73 基因的小鼠品系。对携带野生型 p73 和正常 p73 基因的小鼠进行食管空肠吻合术。处死 15 周龄的小鼠，取下下食管，通过免疫组织化学进行分析。
结果[6]
[edit | edit source]用 BA 混合物处理非肿瘤性食管 HET-1A 细胞，并使用磷酸化 H2A.X 和 8-氧鸟嘌呤抗体通过免疫荧光分析 DNA 损伤。少量暴露于 BA 混合物会通过氧化和链断裂造成 DNA 损伤。然后分析了 BA/A 处理后 p53 家族的存在。尽管存在 DNA 损伤，但 p53 在丝氨酸 15 的磷酸化没有增加，从而诱导 p53 激活。只有当 HET-1A 细胞用称为顺铂的 DNA 损伤药物处理时，才会出现 p53。BA/A 处理后，p53 水平下降，并在长时间后无法检测到。BA/A 处理 SKGT-4 细胞会导致 p73 上调和激活；分析表明，p73 的诱导独立于 p53。由于上皮细胞中 p73 的 mRNA 水平没有增加，因此表明上调发生在翻译后阶段。c-Abl 蛋白激酶的存在诱导酪氨酸磷酸化，进而激活 p73 蛋白。
通过抑制 p73 蛋白，明显的氧化性 DNA 损伤会增加。P73 通过直接与这两种糖基化酶结合并调节其转录来激活参与碱基切除修复的 SMUG1 和 MUTYH。因此，p73 蛋白的下调会降低 SMUG1 和 MUTYH 的两种糖基化酶[6]。
参考文献
[edit | edit source]- ↑ a b Andrea Bisso、Licio Collavin 和 Giannino Del“p73 作为癌症治疗的药物靶点”意大利特里斯特科学园区帕德里奇亚诺 99 号国家 CIB 实验室。意大利特里斯特大学生命科学系，Via L. Giorgieri 1 号，34100，特里斯特。
- ↑ a b c d e f Viadiu，Hector。“P53 蛋白家族的基因识别。”CHEM 114A 讲座。加州大学圣地亚哥分校，拉荷亚。2012 年 11 月 14 日。讲座。
- ↑ a b c d e f g h i j k l m N. Allocati，C. Di Ilio，V. De Laurenzi，细胞周期和细胞死亡控制中的p63/p73，实验细胞研究，第 318 卷，第 11 期，2012 年 7 月 1 日，第 1285-1290 页，ISSN 0014-4827，10.1016/j.yexcr.2012.01.023。（http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482712000444)
- ↑ a b c d e f g Maas，Anna-Maria，Anne Catherine Bretz，Elisabeth Mack 和 Thorsten Stiewe。“靶向癌症中的 P73。”癌症快报 (2011): n. pag。网络。
- ↑ a b Irwin，Meredith S.“化疗敏感性中的家族争端。”细胞周期 3.3 (2004): 319-23。PubMed.gov。网络。2012 年 11 月 14 日。<http://www.landesbioscience.com/journals/cc/irwinCC3-3.pdf.
- ↑ a b c d e Zaika，Elena，Jinxiong Wei，Dengping Yin，Claudia Andl，Ute Moll，El-Rifai 和 Alexander Zaika。“p73 蛋白调节 DNA 损伤修复。”FASEB 杂志。25。(2011): 1-9. 打印。