结构生物化学/蛋白质/纯化/离子交换色谱法
目的：利用离子电荷的性质，从混合物中分离特定的蛋白质。
离子交换色谱法 (IEC) 是一种 纯化 方法，旨在根据电荷分离蛋白质，该电荷取决于流动相的组成（分离溶解的混合物）。调整“流动相”的pH值或离子浓度可以实现分离。例如，如果蛋白质在pH 7时具有净正电荷，它将结合到具有负电荷珠的柱上。另一方面，带负电荷的蛋白质不会。例如，如果质子在pH 7时具有净正电荷，那么它将结合到包含羧基的珠柱上，而带负电荷的蛋白质则不会。一旦结合，蛋白质就会通过增加离子浓度来洗脱。蛋白质的运动取决于净电荷密度；净正电荷密度低的蛋白质将首先出现。蛋白质由于蛋白质表面电荷与交换器上带电基团簇之间的静电力而结合到离子交换器上。柱中填充有树脂（通常是纤维素或琼脂糖），树脂上键合着带电基团。这使得带正电荷的 蛋白质（例如）能够结合到柱上的带负电荷珠上，而带负电荷的蛋白质则能够流过柱。因此，离子交换色谱法包括阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。此外，蛋白质必须置换反离子并附着；换句话说，蛋白质上的净电荷将与置换的反离子的符号相同，因此称为“离子交换”。溶液中的蛋白质分子也被反离子中和；总反应必须是电中性的。任何想要纯化的东西都称为样品，分离的部分称为分析物。将样品添加到柱顶，并使用缓冲溶液进行洗脱。
阴离子交换色谱法涉及使用带正电荷的珠子。在酸的纯化中，酸在其羧基上通常带有负电荷，因此利用阴离子交换色谱法。阴离子交换色谱法主要通过离子交换树脂上的胺基与天冬氨酸或谷氨酸侧链的相互作用来收集生物分子，这些侧链的pK值约为4.4。流动相在pH > 4.4下被缓冲，低于该pH值，酸侧链开始质子化，保留率下降。
在pH 4.4以上，保留率基本上取决于蛋白质中存在的阴离子侧链的数量。包括相同数量阴离子侧链的蛋白质通常可以通过在7到10之间修改流动相pH值来分离，在该pH值范围内，组氨酸不被质子化，赖氨酸开始去质子化。
在这个pH区域，蛋白质会发生微妙的变化，影响蛋白质与树脂的相互作用，并允许对阴离子交换分离进行微调。不建议使用pH > 10的流动相，因为在较高pH值下可能会发生蛋白质剥夺，例如脱氨。
在阳离子交换色谱法中，将包含在特定 pH 下具有净正电荷的特定蛋白质的样品添加到柱中。在阴离子交换色谱法中，将包含在特定pH下具有净负电荷的蛋白质的样品添加到柱中。回想一下，净电荷是在给定pH下每个氨基酸特定R基团的偏电荷之和。柱子含有由纤维素（或琼脂糖）珠子组成的树脂，该树脂上共价键合着官能团。对于阳离子交换，使用羧酸盐基团，对于阴离子交换，使用二乙氨基乙基基团。缓冲溶液，也称为流动相，其pH值设置在蛋白质的pI或pKa与柱上珠子的pKa之间。然后，缓冲溶液使样品通过柱子。没有电荷或与珠子具有相同电荷的分子将通过，而具有相反电荷的分子将结合到珠柱上。就像磁铁一样，它会粘住并保持在那里。为了洗脱结合的蛋白质，用盐冲洗柱子，通常是过量的NaCl。在阳离子交换色谱法中，Na+离子将与结合的蛋白质竞争负官能团，在阴离子交换色谱法中，Cl-离子将竞争性地结合柱子。另一种冲洗系统的方法是使用低pH缓冲液。更酸性的条件将降低蛋白质的净电荷（或使其更正）。由于蛋白质现在带有正净电荷，因此它不再觉得有必要与类似电荷的树脂（因为类似电荷相互排斥）在一起，因此将以纯形式从柱中出来。了解蛋白质样品的等电点 (pI) 在离子交换色谱法中可能会有所帮助。回想一下，pI是在化合物净电荷为零时的pH值。因此，如果我们有一个pI很高的化合物，例如10，那么将pH值降至7会导致化合物变为正电荷。相反，如果溶液的pH值高于pI，则蛋白质整体变为负电荷，因此形成更多阴离子。因此，根据蛋白质的pI，可以针对特定的pH值使用不同的溶剂来纯化蛋白质。这也意味着具有两个显著不同的pI的蛋白质在离子交换中最为成功。
如果样品中含有与被分离蛋白质具有相似电荷的杂质，则需要使用pH梯度缓冲溶液。除非蛋白质具有完全相同的氨基酸，否则它们不太可能在完全相同的pH值下具有完全相同的电荷。升高（或降低）pH值，这实际上导致更多分子去质子化（或质子化），将导致分子略微改变电荷（负或正）。这将影响分子与树脂之间的离子相互作用，导致一些分子从柱中洗脱。通过改变pH值，不同的分子将具有不同的电荷密度（或负电荷程度；-2,-1,-3等）。因此，在某个pH值下，蛋白质可能具有更高或更低的电荷密度，因此将以不同的方式结合到树脂上，而电荷密度较低的蛋白质将首先洗脱。
举另一个例子，假设我们正在分析一个空气样品，该样品已收集在空气过滤器上，并通过过滤器提取（将水添加到过滤器中，通过另一个过滤器进行纯化，并将水提取为样品）。然后，通过添加一定量的样品和一定量的水来进一步制备样品，以放入IC（离子色谱仪）中。首先将一系列标准溶液和水通过IC进行校准。标准溶液包含要检测样品中的特定阳离子或阴离子，具体取决于执行的是哪种离子色谱法。所有样品都通过IC后，将为每个标准溶液和样品溶液创建离子色谱图（见图像）。在离子色谱图中，可以看到分析物的分离情况。由于带正电荷或负电荷的树脂，每个分析物以不同的速度通过柱子。在离子色谱图中，可以看到每个分析物通过所需的时间以及存在的量。每个分析物都将在每个样品中以一致的时间通过柱子，因此可以确定每个峰是哪些分析物。
