结构生物化学/蛋白质/纯化/离子交换色谱
目的：利用离子电荷的特性，从混合物中分离特定蛋白质。
离子交换色谱 (IEC) 是一种 纯化 方法，旨在根据电荷分离蛋白质，这取决于流动相的组成（分离溶解的混合物）。调节“流动相”的 pH 值或离子浓度可以实现分离。例如，如果蛋白质在 pH 7 时具有净正电荷，它将结合到带负电荷的珠子柱上。另一方面，带负电荷的蛋白质不会。例如，如果质子在 pH 为 7 时具有净正电荷，那么它将结合到包含羧基的珠子柱上，而带负电荷的蛋白质则不会。一旦结合，通过增加离子浓度即可洗脱蛋白质。蛋白质的运动取决于净电荷密度；净正电荷密度低的蛋白质将首先出现。蛋白质由于蛋白质表面电荷和交换器上带电基团簇之间的静电力而结合到离子交换器上。色谱柱填充有带有结合到其上的带电基团的树脂（通常是纤维素或琼脂糖）。这使得带正电荷的 蛋白质（例如）能够结合到色谱柱上带负电荷的珠子上，而带负电荷的蛋白质则能够流出色谱柱。因此，离子交换色谱包括阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。此外，蛋白质必须置换抗衡离子并被附着；换句话说，蛋白质上的净电荷将与置换的抗衡离子的符号相同——因此是“离子交换”。溶液中的蛋白质分子也被抗衡离子中和；总反应必须是电中性的。任何想要纯化的东西都被称为样品，而分离的部分被称为分析物。样品加入色谱柱顶部，使用缓冲溶液洗脱。
阴离子交换色谱涉及使用带正电荷的珠子。在酸的纯化中，酸通常在其羧基上带有负电荷，因此利用阴离子交换色谱。阴离子交换色谱主要通过离子交换树脂上的胺基与天冬氨酸或谷氨酸侧链（pK 约为 4.4）的相互作用来收集生物分子。流动相在 pH>4.4 时被缓冲，低于此 pH 值，酸侧链开始质子化，保留率下降。
在 pH>4.4 时，保留率基本上取决于蛋白质中存在的阴离子侧链的数量。包括相同数量的阴离子侧链的蛋白质通常可以通过改变 7 到 10 之间的流动相 pH 值来分离，其中组氨酸没有被质子化，赖氨酸开始被去质子化。
在这个 pH 区域中，蛋白质会发生微妙的变化，这些变化会影响蛋白质与树脂的相互作用，从而可以对阴离子交换分离进行微调。流动相 pH>10 通常不建议，因为在较高 pH 值下可能会出现蛋白质降解，例如脱氨。
在阳离子交换色谱中，将包含在特定 pH 下具有净正电荷的特定蛋白质的样品加入到色谱柱中。在阴离子交换色谱中，将包含在特定 pH 下具有净负电荷的蛋白质的样品加入到色谱柱中。请记住，净电荷是在给定 pH 值下每个氨基酸特定 R 基团的部分电荷的总和。色谱柱含有由纤维素（或琼脂糖）珠子组成的树脂，这些珠子上共价结合着功能基团。对于阳离子交换，使用羧酸盐基团，而对于阴离子交换，使用二乙氨基乙基基团。缓冲溶液，也称为流动相，其 pH 值设置在蛋白质的 pI 或 pKa 与色谱柱上珠子的 pKa 之间。然后，缓冲溶液将样品通过色谱柱。不带电荷或与珠子带相同电荷的分子将通过，而带相反电荷的分子将结合到珠子柱上。就像磁铁一样，它会粘在那里。为了洗脱结合的蛋白质，用盐（通常是过量的 NaCl）冲洗色谱柱。在阳离子交换色谱中，Na+ 离子将与结合的蛋白质竞争负功能基团，而在阴离子交换色谱中，Cl- 离子将竞争结合色谱柱。另一种冲洗系统的方法是使用低 pH 缓冲液。更酸性的条件会降低蛋白质的净电荷（或使其更正）。由于蛋白质现在带有正净电荷，它不再被迫与类似电荷的树脂（因为类似电荷相互排斥）一起存在，因此将从色谱柱中纯净地流出。了解蛋白质样品的等电点 (pI) 在离子交换色谱中可能会有所帮助。请记住，pI 是化合物净电荷为零的 pH 值。因此，如果我们有一个 pI 很高的化合物，例如 10，那么将 pH 值降至 7 会导致化合物变为正电荷。相反，如果溶液的 pH 值高于 pI，则蛋白质总体上会变为负电荷，因此会形成更多的阴离子。因此，根据蛋白质的 pI，可以针对特定 pH 值的不同溶剂来纯化蛋白质。这也意味着，具有两个显著不同 pI 的蛋白质在离子交换中最为成功。
如果样品中存在与要分离的蛋白质具有类似电荷的杂质，则需要 pH 梯度缓冲溶液。除非蛋白质具有完全相同的氨基酸，否则它们不太可能在完全相同的 pH 值下具有完全相同的电荷。提高（或降低）pH 值，实际上会导致更多分子被去质子化（或质子化），这会导致分子略微改变负电荷（或正电荷）。这将影响分子与树脂之间的离子相互作用，导致一些分子从色谱柱中洗脱。通过改变 pH 值，不同的分子将具有不同的电荷密度（或负电荷程度；-2、-1、-3 等）。因此，在某个 pH 值下，蛋白质可能具有较高或较低的电荷密度，因此将以不同的方式结合到树脂上，而电荷密度较低的蛋白质将首先洗脱。
举另一个例子，假设我们正在分析一个已经收集到空气过滤器上并经过过滤器萃取的空气样本（在过滤器中添加水，通过另一个过滤器进行纯化，然后提取水作为样品）。然后，通过添加一定量的样品和一定量的水，将样品进一步制备以放入 IC（离子色谱仪）中。首先，一系列标准溶液和水通过 IC，以便校准仪器。标准溶液由某些阳离子或阴离子组成，具体取决于正在进行的离子色谱，这些离子将要检测到的样品中。一旦所有样品都通过 IC，就会为每个标准溶液和样品溶液创建离子色谱图（见图像）。在离子色谱图中，可以观察到分析物的分离。每个分析物以不同的速度通过色谱柱，这是因为树脂带有正电荷或负电荷。在离子色谱图中，可以观察到每个分析物通过的时间以及存在的量。每个分析物将在每个样品中始终如一地经过色谱柱，因此每个峰都可以确定为某些分析物。
