结构生物化学/蛋白质/蛋白质序列测定技术

目的

蛋白质的氨基酸序列是了解其功能、结构和历史的宝贵来源。 1. 可以将蛋白质的序列与其他已知序列进行比较，以确定是否存在重大相似性。使用计算机，搜索新测序蛋白质与数百万个先前测序蛋白质之间的亲缘关系只需几秒钟。如果新分离的蛋白质属于已知的蛋白质类别，我们可以推断有关该蛋白质结构和功能的信息。 2. 不同物种之间同一蛋白质序列的比较揭示了进化途径。基于蛋白质序列之间的差异，可以推断出物种之间的系谱关系。假设蛋白质的突变率是恒定的，分析不同物种不同蛋白质的序列可以提供信息，说明这两个进化谱系何时分化。例如，比较灵长类动物中发现的血清白蛋白表明，人类和非洲类人猿在 500 万年前而不是 3000 万年前分化。 3. 可以搜索氨基酸序列中是否存在内部重复。这种重复揭示了蛋白质的历史，许多蛋白质源于原始基因的重复，然后是多样化。 4. 许多蛋白质包含充当其目的地信号或控制其过程的氨基酸序列。 5. 序列为制备针对目标蛋白质的特异性抗体提供了基础。氨基酸序列的一部分在注射到小鼠或兔子体内时会引发抗体。这些特异性抗体可用于确定血液中蛋白质的含量。 6. 氨基酸序列对于制作用于编码其蛋白质的 DNA 探针很有价值。通过了解一级结构，它允许使用反向遗传学。可以根据遗传密码构建对应于氨基酸序列部分的 DNA 序列。这些 DNA 序列可用作探针来分离编码该蛋白质的基因，以便可以确定整个序列。该基因反过来可以提供有关该蛋白质的生理调节的信息。

确定氨基酸序列

1. 水解
将肽在 110 ^o C 的 6M 盐酸 (HCl) 中加热 24 小时。此过程是将肽链水解成其氨基酸所必需的。

2. 分离
通过在磺化聚苯乙烯上的离子交换色谱柱上用 pH 升高的缓冲液洗脱混合物，识别来自肽的氨基酸。使用的缓冲液体积可以与特定类型的氨基酸相关联。侧链最酸性的氨基酸将首先出现，而侧链最碱性的氨基酸将最后出现。每种氨基酸的量（一种、两种或三种相同类型的残基）可以通过吸光度来确定。

3. 定量
通过使肽中的氨基酸与茚三酮反应来量化它们，茚三酮用于检测微克的氨基酸。大多数氨基酸会呈现出强烈的蓝色，而脯氨酸由于其结构中的仲胺基而呈现出黄色。此外，为了检测纳克的氨基酸，可以使用与α-氨基反应的菼光胺，产生高度菼光的产物。氨基酸的浓度与用茚三酮处理的样品的吸光度或用菼光胺处理的样品的菼光发射成正比。

这种方法只告诉你蛋白质的组成，而不是氨基酸的顺序。埃德曼降解是提供蛋白质中氨基酸序列顺序的方法。

然后在确定氨基酸组成后，确定氨基酸序列。它可以使用两种互补的方法完成

1.埃德曼降解

该方法通过逐个从氨基末端裂解氨基酸来完成。用于此过程的化学物质是苯异硫氰酸酯。与这种化学物质反应的氨基酸将形成苯硫代氨基丹酰 (PTH)-氨基酸（例如 PTH-甘氨酸）。在弱酸性条件下，(PHT)-一个末端残基被释放。然后使用色谱方法识别这种化合物。埃德曼降解执行起来相当简单（测序仪是自动化的），但这种方法对长肽（超过 50 个残基）无效，因为它执行一个降解循环需要一个小时。

色谱方法的一个例子是高效液相色谱。在此过程中，PTH-氨基酸被分离成其组分，以便可以通过其吸光度和洗脱时间找到氨基酸的特性。

埃德曼降解是在不破坏残基之间键的情况下对蛋白质进行测序的最有效的技术。此外，自动化测序仪的开发使得多肽测序更快、更高效。

使用各种化学物质和酶进行控制切割

有关特殊酶和化学物质的清单，请参见[1]

已知某些化学物质和酶会在特定位置切割肽（例如：某些氨基酸的氨基或羧基端）。使用这些化学物质和酶，可以将肽切割成可以通过埃德曼降解分析的片段。通过组合两种或多种在不同位置切割肽的化学物质和酶，得到的较小片段（其氨基酸序列已通过埃德曼降解确定）可以像拼拼图一样组合在一起。

埃德曼降解的局限性

即使长度小于 50 个氨基酸的肽，在进行埃德曼降解时也可能出现问题。这种情况的一个例子是当氨基酸的 N 末端处于不利的位点时，例如蛋白质的内部，或者当它被隔离时。此外，埃德曼降解可能会由于蛋白质的翻译后修饰而失败，例如糖基化、乙酰化、磷酸化和脂肪酸添加。例如，氨基酸的甲酰化将阻止与苯异硫氰酸酯的反应。特别是，两个半胱氨酸 (Cys) 之间的二硫键可能会通过隔离 N 末端或空间阻碍苯硫脲中间体的环化来使测序复杂化。这可以通过还原二硫键（用 β-巯基乙醇或 DDT）和用甲酸氧化半胱氨酸侧链至其相应的磺酸来进行修饰，以防止二硫键的形成，然后像往常一样执行序列。

2. 质谱法

质谱法是另一种可用于确定蛋白质序列的技术，但它只能通过特定酶裂解的片段识别母体蛋白质。通过测量这些离子被激光束触发并穿过飞行管到达检测器时的飞行时间，可以获得电离蛋白质的质量。由于牛顿第二定律 (F = ma)，质量较轻的离子将移动得更快，并首先到达检测器。然后分析记录的质谱图，并与已测序蛋白质的数据库进行比较。因此，如果用不同的酶重复该过程，可以详细确定蛋白质片段的序列；片段变得更小，因此可以将重叠片段用于确定顺序。

质谱法的局限性

使用质谱法来确定蛋白质序列的一个局限性是在多种氨基酸具有特定质量的情况下。例如，由于亮氨酸和异亮氨酸具有相同的分子量 (131.17 g/mol)，因此对于这两种氨基酸会获得相同的质谱数据，在这种情况下，这种方法无效。

参考文献

Berg, Jeremy M. 生物化学。第 7 版。 (79-80)