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等电聚焦

等电点，也称为蛋白质的pI，是指蛋白质净电荷为零时的pH值。等电聚焦是一种分离技术，根据蛋白质的等电点（或其残基的酸碱度）分离肽。带有pH梯度的凝胶被用作介质。pH梯度通过将具有不同pI的多电荷聚合物（即两性电解质）添加到凝胶中来形成。然后将样品置于凝胶上并施加电压。蛋白质将沿着凝胶移动，直到它们达到它们的等电点。换句话说，每种蛋白质都会移动直到它到达凝胶中pH值等于蛋白质pI的位置。然后可以去除在给定pH值下形成的蛋白质带并进一步分析。该过程可以成功地分离净电荷差大于或等于1的蛋白质。

等电点（pI）：蛋白质净电荷为零时的pH值。对于具有许多碱性氨基酸的蛋白质，pI将较高，而对于酸性蛋白质，pI将较低。

等电聚焦是一种区域电泳，通常在凝胶中进行，它利用了这样一个事实，即分子的电荷会随着其周围环境的pH值而变化。在低于其等电点（pI）的pH区域中的蛋白质将带正电荷，因此将迁移到阴极。然而，随着它迁移，电荷会减少，直到蛋白质到达与其pI对应的pH区域。此时它没有净电荷，因此迁移停止。结果，蛋白质被聚焦成尖锐的静止带，每种蛋白质位于与其实际pI对应的pH梯度中的一个点。该技术能够实现极高的分辨率，即使差异仅为一个电荷的蛋白质也能被分馏成单独的带。

要聚焦的分子分布在具有pH梯度的介质上（通常由脂肪族两性电解质产生）。电流通过介质，产生“正”阳极和“负”阴极端。带负电荷的分子通过介质中的pH梯度迁移到“正”端，而带正电荷的分子迁移到“负”端。当一个粒子向与其电荷相反的极移动时，它会穿过不断变化的pH梯度，直到它到达一个点，在那里达到该分子的等电点的pH值。此时，分子不再具有净电荷（由于相关官能团的质子化或去质子化），因此不会在凝胶中继续移动。在添加目标粒子之前，首先通过对含有不同pI值的少量分子（如两性电解质）的溶液进行电泳来建立梯度。

该方法应用于蛋白质研究，蛋白质根据其酸性和碱性残基的相对含量进行分离，其值由pI表示。将蛋白质引入到由聚丙烯酰胺、淀粉或琼脂糖组成的固定pH梯度凝胶中，其中已建立了pH梯度。等电聚焦可以解析pI值相差仅0.01的蛋白质。等电聚焦是二维凝胶电泳的第一步，其中蛋白质首先根据其pI进行分离，然后通过SDS-PAGE进一步根据分子量进行分离。

如何确定氨基酸的pI

当我们知道其pK_a值时，我们可以通过用NaOH滴定来确定每个氨基酸的pI。例如，最小的氨基酸甘氨酸有两个pK_a值，分别为2.34和9.60。[1]

首先，加入强酸并使甘氨酸完全质子化。然后逐渐加入NaOH，直到pH升至2.34。此时，我们使用0.5摩尔的NaOH相当于甘氨酸的第一个质子化形式。此外，溶液中会生成0.5摩尔的第二质子化形式。在使用1摩尔的NaOH相当于第一个质子化形式后，将只剩下第二质子化形式。我们将看到甘氨酸的第二质子化形式是两性离子，它是净电荷为零的分子。因此，此时pH被称为等电点（pI），等于5.97。继续加入NaOH，直到pH等于9.60。此时，溶液中存在0.5摩尔的第三质子化形式，NaOH的总量为1.5摩尔。回到pI，我们看到

$pI={\frac {2.34+9.60}{2}}=5.97$

然后我们可以写成一般形式

                   $pI={\frac {pK_{a1}+pK_{a2}}{2}}$

备注 要确定具有两个以上pK_a值的氨基酸的pI，我们将使用覆盖两性离子存在于溶液中的范围内的两个pK_a值。[2]