结构生物化学/蛋白质/纯化/盐析

简介

"盐析"过程是一种纯化方法，它依赖于蛋白质溶解度的基础。它依赖于大多数蛋白质在高盐浓度溶液中溶解度较低的原理，因为添加盐离子会屏蔽带有多个离子电荷的蛋白质。这些电荷有助于蛋白质分子相互作用、聚集并沉淀。导致沉淀的确切浓度因蛋白质而异，从而允许分离不同的蛋白质（因为蛋白质在盐浓度增加时将在不同的点沉淀）。盐析还可以浓缩稀释的蛋白质溶液；一旦蛋白质沉淀，就可以除去剩余的液体。然而，盐会对蛋白质的纯度造成问题。

"盐溶"是指在低盐浓度溶液中，蛋白质的溶解度随着盐的添加而增加的现象。由于盐的溶解度高于蛋白质，它更有可能溶解并占据溶液中的空间；因此，蛋白质聚集并沉淀。相比之下，"盐析"需要高盐浓度才能使蛋白质沉淀。有两种"盐析"方法。在一种方法中，蛋白质暴露于高浓度的盐溶液中，在另一种方法中，蛋白质暴露于一系列低浓度的溶液中。

蛋白质包含各种氨基酸序列和组成。因此，它们对水的溶解度因其表面的疏水或亲水特性的程度而异。表面具有更大疏水特性的蛋白质会很容易沉淀。离子的添加会产生电子屏蔽效应，使水颗粒和蛋白质之间的一些活性失效，降低溶解度，因为蛋白质彼此结合并开始聚集。一般来说，较大的蛋白质比重量较小的较小的蛋白质需要更少的离子输入。

在使用低浓度盐溶液的过程中，蛋白质在过程早期沉淀。为了从溶液中提取蛋白质，将一系列浓度递减的冷硫酸铵溶液用于沉淀物。为了回收提取的蛋白质，然后通过将冷溶液加热到室温使其再结晶。这个过程有很多优点，因为根据提取的蛋白质的不同，效率率可以达到30-90%，而且很少失败。

硫酸铵是用于选择性沉淀蛋白质的常见物质，因为它在水中非常可溶，允许约4M的高浓度。在这种状态下，蛋白质的有害效应，如不可逆的变性，是不存在的，并且NH_4⁺ 和 SO_4^2- 都是有利的，非变性的，霍夫迈斯特序列的末端。硫酸铵可以从混合物中定量沉淀一种蛋白质。这种方法对于从细胞提取物中纯化可溶性蛋白质非常有用。⁴

虽然盐析被证明是一种有效的蛋白质分离方法，但它要求在最初计算或知道蛋白质的溶解度。蛋白质具有不同的氨基酸链和溶解度。在试图改变盐浓度以使蛋白质变得不溶时，不同的离子可以增加或降低蛋白质的溶解度。因此，必须谨慎选择正确的离子来改变盐浓度。蛋白质在其等电点 pI 附近或其净电荷最小时通常溶解度最低。盐析沉淀导致分级分离。在一种盐浓度下收集一定量的沉淀蛋白质，而在另一种浓度下收集另一部分。这是因为蛋白质的某些部分可能比另一个区域更容易溶解。

具有不同 pI 值的蛋白质可以通过盐析技术在不同的盐浓度下通过动态 pH 值进行分离。由于蛋白质在其等电点 (pI) 附近溶解度最低，因此可以通过增加盐浓度使其从溶液中沉淀出来。这是可能的，因为包围蛋白质结构的水化层被溶剂中增加的离子浓度所取代。因此，通过用其他离子取代水化层，溶解蛋白质的水网络变得不稳定，并允许蛋白质在高盐浓度下由于疏水基团聚集在一起而聚集。最终，蛋白质通过聚集（或“析出”）而沉淀。这种技术可用于分离最初具有相似沉淀点的蛋白质。通过改变溶液的 pH 值，可以增加或降低一种蛋白质的溶解度，而不影响目标蛋白质。此外，溶液可以通过透析来去除溶液中的盐离子，从而进一步纯化。

霍夫迈斯特序列

弗朗茨·霍夫迈斯特于 1888 年确定了不同离子的有效性。阴离子和阳离子系列中的第一个离子是使蛋白质最有效地沉淀出来的（被称为“促溶剂”：与水相互作用良好的离子，形成氢键并脱水蛋白质），而末尾的离子是最低效的（被称为“致溶剂”：通过破坏水分子之间的氢键来释放水，增加蛋白质溶解度的离子）。^

阳离子: N(CH₃)₃⁺ > NH₄⁺ > K⁺ > Li⁺ > Mg²⁺ > Ca²⁺ > Al³⁺ > 胍

阴离子: SO₄^2- > HPO₄^2- > CH₃COO^- > 柠檬酸根 > 酒石酸根 > F^- > Cl^- > Br^- > I^- > NO₃^- > ClO₄^- > SCN^-

起始分子通过降低非极性分子的溶解度来增强疏水相互作用，从而使系统盐析。然而，后面的分子由于破坏氢键的强离子相互作用而开始使蛋白质结构变性。虽然后面的分子可以通过硫酸铵等溶液进行盐析，但某些分子也会经历盐溶，其中蛋白质的溶解度通过列表中的后面分子而增加。

透析

透析是一种蛋白质纯化过程，它使用半透膜将蛋白质与其他小分子（如盐）分离。这种膜包含微孔，小分子会从这些孔中逸出。因此，尺寸明显大于孔径的蛋白质分子被保留在透析袋内。小分子和盐会通过膜扩散到袋外的透析液中。这种技术有助于去除盐离子和其他小分子，但不能用于区分蛋白质。为了增强袋中蛋白质与其他杂质（如盐）的分离，我们还可以利用平衡常数。在水性环境中，盐会流过细胞膜，直到其在透析袋外的浓度等于袋内的浓度。此时，由于达到平衡，没有净盐流过膜。但是，如果我们加入新的缓冲液溶液，那么剩余的盐量将流出透析袋，直到缓冲液中的盐浓度等于透析袋中的浓度。如果我们不断更换缓冲液，这将提高透析袋中蛋白质的纯度，因为每次我们更换缓冲液时，盐都必须流出以达到其平衡常数。这一原理也可以应用于能够通过膜逸出的其他杂质。

人体透析

在肾脏功能受损的患者中，透析通常用作去除血液中不需要的溶质的程序。例如，透析液中的钙、钾和尿素浓度保持在低浓度，使血液中的目标溶质能够穿过半透膜扩散。然而，这需要不断清洗透析液，以防止浓度平衡，这最终会导致血液中不需要的溶质浓度升高。在另一种情况下，溶质也可以被引入血液。例如，透析液中碳酸氢根离子的浓度很高，会扩散穿过膜。这样做是为了防止代谢性酸中毒。

参考文献

1. Berg, Jeremy M. 2007. Biochemistry. 第六版。纽约：W.H. Freeman。68-69, 78。

2. Voet, Voet, Pratt (2004). - 生物化学基础

3. [[1]] 肾脏疾病图谱，第 5 卷，透析原理：扩散、对流和透析机

4 ^[2] “第9章：蛋白质表达、纯化和表征”，《蛋白质：结构与功能》，Whitford 著，2005 年，John Wiley & Sons, Ltd

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