蛋白质组学/蛋白质分离 - 电泳/一维凝胶电泳

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)

这是一种非常常见的凝胶电泳方法，用于根据质量分离蛋白质。最常用的系统也称为 Laemmli 方法，以 U.K. Laemmli 命名，他是第一个在科学研究中使用 SDS-PAGE 并发表论文的人。蛋白质溶解在十二烷基硫酸钠 (SDS) 中，这是一种表面活性剂，可破坏蛋白质之间的相互作用，然后进行电泳。最小的分子更快地穿过凝胶，而较大的分子需要更长的时间，从而导致靠近凝胶顶部的条带。

凝胶

用于 SDS-PAGE 的凝胶由丙烯酰胺制成，丙烯酰胺形成交联的聚丙烯酰胺聚合物。标准凝胶通常由两层组成，最上面的一层称为堆积凝胶，下面的一层称为分离凝胶或解析凝胶。堆积层包含低百分比的丙烯酰胺，并且 pH 值较低，而分离凝胶的丙烯酰胺浓度根据待运行的样品而变化，并且 pH 值较高。堆积凝胶和分离凝胶之间的 pH 和丙烯酰胺浓度差异在分离凝胶中提供了更好的分辨率和更清晰的条带。

程序

样品用 SDS（十二烷基硫酸钠）处理，SDS 是一种阴离子去污剂，通过破坏二硫键使蛋白质变性，并根据蛋白质的质量为每个蛋白质提供负电荷。如果没有 SDS，由于折叠模式的差异，具有相似分子量的不同蛋白质会迁移不同，因为折叠模式的差异会导致某些蛋白质比其他蛋白质更容易穿过凝胶基质。SDS 使蛋白质线性化，以便它们可以严格地根据分子量分离。SDS 以约 1.4 g SDS/1.0 g 蛋白质的比例与蛋白质结合 [[1]]，为大多数蛋白质提供近似均匀的质量/电荷比，因此可以假设凝胶中的迁移距离与蛋白质的大小直接相关。蛋白质可以进一步用还原剂处理，如二硫苏糖醇 (DTT) 或 TRP（三丁基膦），以破坏任何重新形成的二硫键，然后用碘乙酰胺烷基化以防止二硫键的重新形成。可以在蛋白质溶液中添加溴酚蓝等跟踪染料以跟踪电泳运行过程中蛋白质溶液通过凝胶的进度。

电泳

通过 SDS 变性的蛋白质被应用到浸没在缓冲液中的聚丙烯酰胺凝胶层的一端。缓冲液提供均匀的 pH 值和离子以传导电势。当在凝胶上施加电流时，带负电荷的蛋白质会穿过凝胶迁移到正极。短的蛋白质更容易穿过凝胶中的孔隙并快速移动，而较大的蛋白质则会遇到更多困难。由于基于它们大小的差异迁移，较小的蛋白质会向下移动得更远，而较大的蛋白质会停留在起点附近。在一段时间后，蛋白质可能已根据其大小粗略地分离。可以将已知分子量的蛋白质（标记蛋白质）在凝胶的单独泳道中运行以校准凝胶。

染色和分析

电泳后，可以用考马斯亮蓝或银染色对凝胶进行染色以使分离的蛋白质可视化。染色后，不同的蛋白质会根据其大小（因此根据分子量）在凝胶中显示为不同的条带。可以根据与已知分子量的标记蛋白质的比较来估计条带中蛋白质的分子量。可以从凝胶中切下分离的蛋白质，并通过其他蛋白质组学技术进一步分析。

等电聚焦 (IEF)

在等电聚焦中，蛋白质根据其等电点 (pI) 在 pH 梯度中通过电泳分离。在凝胶中生成 pH 梯度，并在凝胶上施加电势。在除等电点以外的所有 pH 值下，蛋白质都会带电荷。如果蛋白质带正电荷，它们会向凝胶的负端移动，如果蛋白质带负电荷，它们会向凝胶的正端移动。在其等电点，由于蛋白质分子不带净电荷，因此它会积累或聚焦成一个尖锐的条带。

固定化 pH 梯度 (IPG) 和 IEF 运行

固定化 pH 梯度用于 IEF，因为固定 pH 梯度在非常高的电压下会长时间保持稳定。IPG 的 pH 梯度是通过共价结合到聚丙烯酰胺凝胶中的缓冲化合物生成的。IPG 是具有塑料背衬层的铸造条，在不同的 pH 范围内和长度上是可商购的。它们提供高分辨率，良好的可重复性，并允许高蛋白质负载。等电聚焦在用于提取或溶解蛋白质的相同溶液中进行。带有蛋白质样品的 IPG 条必须在再水化/样品缓冲液中再水化，在此期间蛋白质样品被加载到条带中。再水化可以是主动的或被动的。为了加载较大的蛋白质，在小电压下进行主动再水化。随着样品进行电泳，蛋白质会根据电荷向阳极或阴极迁移。蛋白质将在达到其各自的 pI 时停止。在 IEF 电泳槽中运行后，蛋白质会根据其等电点聚焦成条带。聚焦的条带可以冷冻储存。

天然 PAGE

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native PAGE) 用于根据蛋白质的电荷密度差异分离处于天然状态的蛋白质。蛋白质的天然状态是指蛋白质处于正确折叠状态，而不是变性或未折叠状态。凝胶和缓冲液中不存在变性剂，凝胶中的缓冲液使蛋白质保持其天然状态。许多蛋白质在通过非变性 PAGE 分离后被证明具有酶活性。因此，它被用于制备纯化和活性蛋白质。在非变性 PAGE 中，迁移率取决于蛋白质的电荷和流体力学尺寸。电荷取决于蛋白质的氨基酸组成以及翻译后修饰。天然蛋白质在凝胶上的流体力学尺寸和迁移率会随着构象的性质而变化。具有紧凑构象的蛋白质具有更高的迁移率，而较大的结构（如寡聚体）具有较低的迁移率。非变性 PAGE 可在接近中性 pH 的条件下进行，以避免酸性或碱性变性，从而研究构象以及自缔合或聚集，以及其他蛋白质或化合物的结合。仪器保持冷却以最大程度地减少蛋白质的变性和蛋白水解。

参考文献