结构生物化学/蛋白质/纯化/亲和层析

亲和层析是一种可应用的技术，用于纯化蛋白质。它基于蛋白质对特定化学基团的高亲和力的优势进行。亲和层析是由 Pedro Cuatrecasas 和 Meir Wilcheck 在 1968 年发现的。

此过程通常用于从蛋白质池中分离感兴趣的蛋白质。一个柱子装满了含有共价连接的葡萄糖残基的珠子。考虑到这些残基是根据目标蛋白质选择的。当蛋白质混合物倒入柱子时，蛋白质会穿过珠子向下流动。目标蛋白质将被识别并通过共价键捕获到柱子上，因为它对葡萄糖具有亲和力。其余的蛋白质将向下流到柱子并被分离。需要添加到柱子中的缓冲液部分用于完全洗脱未结合的蛋白质。最后，添加浓缩的葡萄糖溶液以将目标蛋白质与柱子连接的葡萄糖残基分离。

起始部分包含溶液中未定义的异质分子混合物。所需分子将具有定义的特性，这些特性可以在亲和纯化过程中被利用。该过程是一个设置，其中目标分子被捕获在固定介质上。非目标异质混合物由于其无结合能力而不会被捕获。然后可以将固体介质从混合物中去除，多次洗涤，然后在称为洗脱的过程中以高浓度的特定化学物质释放目标分子或改变条件以降低结合能力。此外，重要的是反应在合适的 pH 值下进行；否则，它可能会降低亲和力并改变蛋白质的构象，从而阻止目标蛋白质按预期与残基结合。

亲和层析是一种分离转录因子的强大方法，转录因子是通过与特定DNA序列结合来调节基因表达的蛋白质。将蛋白质混合物通过含有连接到基质上的特定 DNA 序列的柱子渗透。对该序列具有高亲和力的蛋白质将结合并被保留。在这种情况下，转录因子通过用含有高浓度盐的溶液洗涤来释放。

一般来说，亲和层析可以有效地用于分离识别 X 基团的蛋白质：将 X 或其衍生物共价连接到柱子上，将蛋白质混合物添加到该柱子上，然后用缓冲液洗涤以去除未结合的蛋白质，然后通过添加高浓度的 X 的可溶性形式或改变条件以降低结合亲和力来洗脱所需的蛋白质。当蛋白质与用作诱饵的分子之间的相互作用高度特异时，亲和层析最有效。

利用

亲和层析主要用于生物化学领域

• 从混合物中纯化特定蛋白质

• 减少多种蛋白质混合物中特定蛋白质分子的数量

• 发现物质对生物化合物的亲和力，在本例中为蛋白质。

组合化学

亲和层析也可以用于组合化学（体外进化），其中您可以通过创建大量分子并选择特定功能来模仿进化过程。在这种情况下，您从多种分子群体开始，然后选择特定的蛋白质，并复制该分子。例如，从随机的 RNA 片段池和 ATP 亲和柱开始，您将 RNA 池应用到柱子的顶部。接下来，您将允许选择 ATP 结合分子，从 RNA 池中洗脱所有未与 ATP 结合的片段。然后，为了洗脱结合的 RNA 分子，您将 ATP 应用到柱子的顶部。这将分离与 ATP 结合的选定 RNA 分子。您可以通过使用不同的盐浓度来扩展这种选择，增加的盐浓度更具选择性。

免疫亲和层析

免疫亲和层析的一个例子是使用血液抗体。血液抗体可以通过使用亲和纯化从血浆（血清）中纯化。如果血浆中存在针对某些特定抗原的抗体，我们可以使用它通过亲和力进行抗原纯化。一个常见的例子是观察生物体是否对 GST 融合蛋白具有免疫力，方法是观察它是否产生针对 GST 标签和融合蛋白的抗体。首先，允许 GST 亲和基质与血浆结合。允许血浆结合有助于去除针对 GST 的抗体。将血浆与固体分离有助于它与 GST 融合蛋白基质结合，这反过来又会将抗体在固体支持物中识别的抗原捕获在其中。使用低 pH（pH 3）缓冲液进行洗脱有助于获得所需的抗体。洗脱液的收集大多在磷酸盐缓冲液中完成，以中和低 pH。

固定化金属离子亲和层析 (IMAC)

IMAC 特别基于氨基酸与金属形成共价键的配位。此技术的概念是在柱中保留对金属离子具有亲和力的蛋白质，这些金属离子被固定在柱子内部。铁、镓或锌可用于纯化磷酸化蛋白质或肽。用于结合组氨酸的常见金属是铜、钴和镍。由于许多天然存在的蛋白质对金属离子没有亲和力，因此使用 DNA 重组技术。

相互作用材料

这些是自然界中典型的生化相互作用，已广泛用于亲和层析

• 酶将与底物类似物、抑制剂和辅因子结合

• 凝集素将与多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞结合

• 抗体将与抗原、病毒、细胞结合

• 核酸将与互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶和核酸结合蛋白结合

• 激素、维生素将与受体、载体蛋白结合

• 谷胱甘肽将与谷胱甘肽-S-转移酶或 GST 融合蛋白结合

• 金属离子将与多（His）融合蛋白、其表面具有组氨酸、半胱氨酸和色氨酸残基的天然蛋白质结合。

第一种技术

通常，亲和层析将通过柱层析进行。首先，必须研究蛋白质的结合能力。然后，用结合材料修饰的固体介质装入层析柱中。然后，将包含所需蛋白质的初始混合物通过柱子添加，以允许结合发生。逐渐向混合物的添加物中添加洗涤缓冲液。洗脱缓冲液随后将未结合的蛋白质从柱子中去除并收集。

洗脱方法

对于所有的亲和介质，没有通用的洗脱方法。当物质与亲和介质紧密结合时，在继续洗脱过程之前，在施加洗脱液后停止流动可能是有益的，通常为 10 分钟到 2 小时。额外的等待时间有助于提高结合蛋白的回收率。

维持底物与结合物质复合物的力包括静电相互作用、疏水相互作用和氢键。预计破坏这些相互作用的试剂将作为有效的洗脱剂发挥作用。实现效率的最佳流速可能因特定的相互作用而异。

pH 洗脱方法

这是最常用的技术之一，用于从配体中去除结合的蛋白质。pH 值的变化会改变配体和/或结合蛋白质上的带电基团。这种变化可能会直接影响结合位点并降低其亲和力。另一方面，pH 值的变化可以通过改变蛋白质构象而间接改变亲和力。突然降低 pH 值是最常用的洗脱结合蛋白质的方法之一。配体和靶蛋白的化学稳定性决定了 pH 值变化的限制。洗脱后，色谱柱应立即恢复至中性 pH 值，以避免蛋白质发生不可逆的变性。

离子强度变化方法

改变缓冲溶液的离子强度会改变配体和靶蛋白之间的特异性相互作用。这种方法是一种温和的洗脱方法，使用离子强度更高的缓冲液（通常是氯化钠），以线性梯度或分步方式施加。

竞争性试剂洗脱

选择性洗脱液通常用于在特定介质上或在配体/靶蛋白相互作用具有高结合亲和力的情况下分离物质。洗脱剂与靶蛋白或配体竞争结合。这是自然界中竞争性抑制剂的一个例子。物质可以通过单一洗脱液的浓度梯度洗脱。在这种方法中，竞争性试剂的浓度应与偶联配体的浓度相等。但是，如果游离竞争性化合物与配体与靶蛋白的结合较弱，则使用更高浓度的竞争性试剂来实现洗脱效率。

例如竞争性亲和色谱，有 R1a 蛋白。靶蛋白 R1a 与 cAMP 树脂结合。R1a 蛋白与 cAMP 之间的相互作用可以使用 cGMP 洗脱缓冲液分离。该 cGMP 与靶蛋白竞争，但是含有高浓度 cGMP 的洗脱缓冲液将与树脂结合得更多。分离的 R1a 蛋白将被洗脱出来。

降低洗脱液极性

使用条件降低洗脱液的极性，以促进洗脱而不使蛋白质失活。二恶烷或乙二醇是这类洗脱液的典型代表。

混乱剂洗脱液

如果其他洗脱方法失败，可以使用改变蛋白质结构的变形缓冲液来实现配体和靶蛋白的分离。典型的混乱剂是盐酸胍和尿素。虽然这种方法将产生最高的回收率，但应尽可能避免使用混乱剂方法，因为它们会使洗脱的蛋白质变性。

组氨酸标签

亲和色谱可以使用多种不同的蛋白质标签进行。实验室中常用的标签之一是聚组氨酸。它的长度较短，不会改变标记蛋白质的构象。组氨酸标记是有利的，因为它非常特异，允许高度纯化。

编码特定蛋白质的基因首先被修饰以包含该标签。可以在表达蛋白的氨基或羧基末端添加一串组氨酸残基。然后将标记的蛋白质通过一个装有共价连接的、固定化的镍（II）（Ni 2⁺。）的珠子的色谱柱。组氨酸标签与固定化的金属离子紧密结合，因为组氨酸的侧链（咪唑）对金属离子（在本例中为镍 II）具有特异性结合亲和力。结果，所需的蛋白质紧密结合到珠子上，而其他蛋白质轻松地流出色谱柱。即使其他不想要的蛋白质（具有组氨酸侧链）也会流出色谱柱，因为它们不像所需的标记蛋白质那样多，后者大约有 6 个相邻的组氨酸残基。然后可以通过添加咪唑或其他一些与金属离子结合并置换蛋白质的化学物质来从色谱柱中洗脱蛋白质。可以通过酶联免疫吸附测定 (ELISA) 验证所需蛋白质的存在。

镍树脂再生

在重组 DNA 中，所需蛋白质上的组氨酸标签和镍树脂通常用于通过亲和色谱来纯化所需的蛋白质。也就是说，组氨酸对镍树脂具有很强的亲和力，不会流出色谱柱。不想要的蛋白质没有设计的组氨酸序列，因此无法与镍树脂结合；这些蛋白质流出色谱柱。在洗脱过程中，我们添加了相对高浓度的咪唑缓冲液。咪唑与我们所需的蛋白质竞争与镍树脂结合。在实践中，镍树脂相当昂贵。镍树脂的再生至关重要。它涉及几个步骤。首先，可能存在一些剩余蛋白质残留在用过的镍树脂上；这些剩余蛋白质使用盐酸胍和相应的缓冲液变性并洗掉。用 Milli Q 水和浓度逐渐增加的乙醇洗涤镍树脂。镍树脂再生的一个重要步骤是重新充电镍。我们首先用 EDTA 去除镍，EDTA 是一种六齿化合物，可以释放镍离子。然后树脂会变成白色，没有镍。然后用高浓度的镍盐重新充电树脂，以获得我们略带绿色的树脂。

谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 标签

GST 对谷胱甘肽具有亲和力，谷胱甘肽以固定化的谷胱甘肽琼脂糖的形式提供。使用过量的谷胱甘肽来置换标记的蛋白质以进行洗脱。与组氨酸标签一起，纯化 GST 标签等重组蛋白是亲和色谱最常见的用途。

GST 是参与细胞防御电性化合物的一种酶。它具有高亲和力和特异性与谷胱甘肽结合。这种相互作用的强度和选择性允许通过基于谷胱甘肽的蛋白质树脂来纯化 GST 标记的蛋白质。谷胱甘肽树脂有效地选择性结合 GST 标记的蛋白质，允许感兴趣的特异性蛋白质以高效率从混合物中分离出来。

GST 是一种 35-KDa 蛋白，它具有小的肽。正是这种特性使人们能够快速进行 GST-蛋白质纯化，而不会被蛋白酶降解并最大程度地减少样品损失。GST 在变性时将失去与谷胱甘肽树脂结合的能力，因此，不能在缓冲液中添加强变性剂（如盐酸胍和尿素）。

凝集素亲和色谱

凝集素蛋白，例如最初从刀豆 Canavalia ensiformis 中提取的刀豆蛋白 A，特异性结合糖中某些特定的结构。凝集素亲和色谱是一种亲和色谱，其中植物蛋白刀豆蛋白 A 通过将粗提物通过装有共价连接的葡萄糖残基的珠子的色谱柱来纯化。由于它对葡萄糖具有亲和力，刀豆蛋白 A 将与这种类型的色谱柱结合。然后添加浓缩的葡萄糖溶液以从色谱柱上除去结合的刀豆蛋白 A。

优点和缺点

优点

• 亲和层析是一种相当可行的技术，因为葡萄糖残基和目标蛋白具有很高的选择性，从而获得了高回收率的纯化产物。

1• 在许多情况下，它可以是一个单步过程。

2• 该技术可用于低浓度物质。

3• 实现了快速分离，同时避免了污染。

4. 与凝胶过滤层析和离子交换层析不同，亲和层析能够一次分离一种特定蛋白质，而其他技术会分离具有相似特性的蛋白质。

缺点

• 必须仔细确定目标蛋白与配体的相互作用。此过程需要昂贵的材料、时间，并且一次只能处理少量蛋白质。

参考文献

生物化学，Berg，第六版，ISBN 0-7167-8724-5

Clontech,http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_id=10594&tabno=2