结构生物化学/蛋白质/纯化/亲和层析
亲和层析是一种可用于纯化蛋白质的技术。它利用蛋白质对特定化学基团的高亲和性来进行。亲和层析是由 Pedro Cuatrecasas 和 Meir Wilcheck 在 1968 年发现的。
此过程通常用于从蛋白质池中分离目标蛋白。一个柱子装满了带有共价连接的葡萄糖残基的珠子。需要考虑的是，这些残基的选择要与目标蛋白相对应。当蛋白质混合物被倒入柱子中时，蛋白质会通过珠子向下移动。由于目标蛋白对葡萄糖的亲和性，它会被识别并通过共价键捕获到柱子上。其余蛋白质会继续向下移动并被分离。需要向柱子中添加一部分缓冲液，以完全洗脱未结合的蛋白质。最后，添加浓缩的葡萄糖溶液，以将目标蛋白从柱子上连接的葡萄糖残基中分离出来。
起始部分包括溶液中未定义的异质分子混合物。所需的分子将具有在亲和纯化过程中可利用的定义性质。该过程的设置是目标分子被捕获在固定介质上。非目标异质混合物由于其未结合的能力而不会被捕获。然后可以从混合物中去除固体介质，洗涤多次，并且目标分子在称为洗脱的过程中从捕获中释放出来，该过程使用高浓度的特定化学物质或改变条件以降低结合能力。此外，重要的是反应在合适的 pH 值下进行；否则，它可能会降低亲和力并改变蛋白质的构象，从而阻止目标蛋白按预期与残基结合。
亲和层析是分离转录因子的有力手段，转录因子是通过与特定DNA序列结合来调节基因表达的蛋白质。蛋白质混合物通过包含连接到基质上的特定 DNA 序列的柱子渗透。对序列具有高亲和力的蛋白质将结合并被保留。在这种情况下，转录因子通过用含有高浓度盐的溶液洗涤来释放。
一般来说，亲和层析可以有效地用于分离识别 X 基团的蛋白质，方法是：将 X 或其衍生物共价连接到柱子上，将蛋白质混合物添加到此柱子上，然后用缓冲液洗涤以去除未结合的蛋白质，然后通过添加高浓度的可溶形式的 X 或改变条件以降低结合亲和力来洗脱所需的蛋白质。当蛋白质与用作诱饵的分子之间的相互作用高度特异时，亲和层析最有效。
亲和层析主要用于生物化学中
• 从混合物中纯化特定蛋白质
• 减少多种蛋白质混合物中特定蛋白质分子的数量
• 发现物质对生物化合物（在本例中为蛋白质）的亲和力。
亲和层析也可用于组合化学（体外进化），其中你可以通过创建大量的分子并选择特定功能来模仿进化过程。在这种情况下，你从多种分子的群体开始，然后选择特定的蛋白质，并复制该分子。例如，从随机的 RNA 片段库和一个 ATP 亲和柱开始，你会将 RNA 库应用到柱子的顶部。接下来，你会允许选择 ATP 结合分子，从 RNA 库中洗脱所有未结合到 ATP 的片段。然后为了洗脱结合的 RNA 分子，你会将 ATP 应用到柱子的顶部。这将分离出与 ATP 结合的选择性 RNA 分子。你可以通过使用不同的盐浓度来扩展这种选择，更高的盐浓度更具选择性。
免疫亲和层析的一个例子是使用血液抗体。血液抗体可以通过从血液血浆（血清）中使用亲和纯化来纯化。如果血浆中存在针对某种特定抗原的抗体，我们可以利用亲和力来纯化该抗原。一个常见的例子是观察生物体是否对 GST 融合蛋白具有免疫力，方法是观察其是否产生针对 GST 标签和融合蛋白的抗体。首先，让 GST 亲和基质与血浆结合。让血浆结合有助于去除针对 GST 的抗体。将血浆从固体中分离出来有助于它与 GST 融合蛋白基质结合，而 GST 融合蛋白基质反过来又会捕获固体支持物中被抗体识别的抗原。使用低 pH（pH 3）缓冲液洗脱有助于获得所需的抗体。洗脱液的收集主要是在磷酸盐缓冲液中进行，以中和低 pH。
IMAC 特别基于氨基酸与金属形成的配位共价键。这种技术的概念是在柱子中保留对金属离子具有亲和力的蛋白质，这些金属离子被固定在柱子内部。铁、镓或锌可用于纯化磷酸化蛋白质或肽。用于结合组氨酸的常见金属是铜、钴和镍。由于许多天然存在的蛋白质对金属离子没有亲和力，因此使用 DNA 重组技术。
这些是自然界中典型的生化相互作用，在亲和层析中得到了广泛的应用
• 酶将与底物类似物、抑制剂和辅因子结合
• 凝集素将与多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞结合
• 抗体将与抗原、病毒、细胞结合
• 核酸将与互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶和核酸结合蛋白结合
• 激素、维生素将与受体、载体蛋白结合
• 谷胱甘肽将与谷胱甘肽-S-转移酶或 GST 融合蛋白结合
• 金属离子将与多（His）融合蛋白、表面具有组氨酸、半胱氨酸和色氨酸残基的天然蛋白质结合。
通常，亲和层析通过柱层析进行。首先，必须研究蛋白质的结合能力。然后，将用结合材料修饰的固体介质填充到层析柱中。接着，将含有目标蛋白质的起始混合物通过柱子，使其发生结合。然后逐渐添加洗涤缓冲液。洗脱缓冲液随后将未结合的蛋白质从柱中去除并收集。
并非所有亲和介质都适用通用洗脱方法。当物质与亲和介质紧密结合时，在继续洗脱过程之前，在施加洗脱液后停止流动可能有用，通常需要 10 分钟到 2 小时。这额外的等待时间有助于提高结合蛋白质的回收率。
维持底物和结合物质复合体的力包括静电相互作用、疏水相互作用和氢键。预计破坏这些相互作用的试剂可以作为有效的洗脱剂。为了达到效率，最佳流速可能因特定相互作用而异。
这是最常用的从配体中去除结合蛋白质的技术之一。pH 值的变化会改变配体和/或结合蛋白质上的带电基团。这种变化可能会直接影响结合位点并降低其亲和力。另一方面，pH 值的变化可以通过改变蛋白质的构象而间接改变亲和力。突然降低 pH 值是洗脱结合蛋白质最常用的方法之一。配体和目标蛋白质的化学稳定性决定了 pH 值变化的限制。洗脱后，应立即将柱子恢复到中性 pH 值，以避免蛋白质不可逆地变性。
改变缓冲液溶液的离子强度将改变配体和目标蛋白质之间的特定相互作用。这种方法是一种温和的洗脱，使用离子强度增加的缓冲液（通常是氯化钠），以线性梯度或分步方式应用。
选择性洗脱剂通常用于分离特定介质上的物质，或在配体/目标蛋白质相互作用的高结合亲和力存在的情况下。洗脱剂竞争性地与目标蛋白质结合或与配体结合。这是自然界中发生的竞争性抑制剂的一个例子。物质可以通过单一洗脱剂的浓度梯度洗脱。在这种方法中，竞争性试剂的浓度应与偶联配体的浓度相等。但是，如果游离竞争性化合物与配体对目标蛋白质的结合力较弱，则使用更高浓度的竞争性试剂才能实现洗脱效率。
例如，竞争性亲和层析中，有一种 R1a 蛋白。目标 R1a 蛋白与 cAMP 树脂结合。R1a 蛋白与 cAMP 之间的相互作用可以使用 cGMP 洗脱缓冲液分离。这种 cGMP 与目标蛋白竞争，但是含有高浓度 cGMP 的洗脱缓冲液将更多地与树脂结合。分离的 R1a 蛋白将被洗脱出来。
使用条件降低洗脱剂的极性，促进洗脱，而不会使蛋白质失活。二恶烷或乙二醇是这类洗脱剂的典型代表。
如果其他洗脱方法失败，可以使用变形缓冲液溶液（改变蛋白质结构）来实现配体和目标蛋白质的分离。典型的破坏性试剂是盐酸胍和尿素。虽然这种方法将产生最高的回收率，但应尽可能避免使用破坏性试剂，因为它们会使洗脱的蛋白质变性。
亲和层析可以使用多种不同的蛋白质标签进行。实验室中常用的标签之一是多组氨酸。它的长度很短，不会改变标记蛋白质的构象。组氨酸标记非常有利，因为它非常特异，可以实现高水平的纯化。
编码特定蛋白质的基因首先被修饰以包含标签。可以在表达蛋白质的氨基或羧基末端添加一串组氨酸残基。然后将标记的蛋白质通过包含共价连接的固定化镍（II）（Ni 2+）的珠子柱。组氨酸标签与固定化的金属离子紧密结合，因为组氨酸的侧链咪唑对金属离子（在本例中为镍 II）具有特定的结合亲和力。因此，目标蛋白与珠子紧密结合，而其他蛋白则很容易通过柱子。即使其他不希望的蛋白质含有组氨酸侧链，它们也会通过，因为它们不像目标标记蛋白那样多，目标标记蛋白大约有 6 个相邻的组氨酸残基。然后可以通过添加咪唑或其他一些与金属离子结合并置换蛋白质的化学物质，将蛋白质从柱中洗脱出来。可以通过酶联免疫吸附测定 (ELISA) 验证目标蛋白质的存在。
镍树脂再生
在重组 DNA 中，目标蛋白上的组氨酸标签和镍树脂通常用于通过亲和层析纯化目标蛋白。也就是说，组氨酸对镍树脂具有很强的亲和力，因此不会通过柱子。不希望的蛋白质没有设计的组氨酸序列，因此无法与镍树脂结合；这些蛋白质会通过柱子。在洗脱过程中，我们添加相对高浓度的咪唑缓冲液。咪唑与目标蛋白竞争与镍树脂结合。在实践中，镍树脂相当昂贵。镍树脂的再生至关重要。它包括几个步骤。首先，可能在使用过的镍树脂上残留一些蛋白质；这些残留的蛋白质使用盐酸胍和相应的缓冲液变性并洗掉。镍树脂用 Milli Q 水和浓度逐渐增加的乙醇洗涤。镍树脂再生中一个重要的步骤是重新充电镍。我们首先用 EDTA（六齿化合物）去除镍， EDTA 会释放镍离子。然后树脂会变成白色，没有镍。然后用高浓度的镍盐对树脂进行重新充电，得到我们略带绿色的树脂。
GST 对谷胱甘肽具有亲和力，谷胱甘肽可作为谷胱甘肽琼脂糖固定化。使用过量的谷胱甘肽来置换标记的蛋白质以进行洗脱。除了组氨酸标签之外，纯化重组蛋白（如 GST 标签）是亲和层析最常见的用途。
GST 是参与细胞防御电气化合物的一种酶。它对谷胱甘肽具有很高的亲和力和特异性。这种相互作用的强度和选择性允许用谷胱甘肽基蛋白树脂纯化 GST 标记的蛋白质。谷胱甘肽树脂有效地选择性地结合 GST 标记的蛋白质，使感兴趣的特定蛋白质能够从混合物中高效分离。
GST 是一种 35-KDa 蛋白，它具有小的肽。正是这种特性使得人们能够快速进行 GST-蛋白质纯化，而不会被蛋白酶降解，并且可以最大限度地减少样品损失。GST 在变性时会失去与谷胱甘肽树脂结合的能力，因此，在缓冲液中不能添加强变性剂，如盐酸胍和尿素。
凝集素蛋白，例如刀豆蛋白 A，最初是从刀豆属植物 *Canavalia ensiformis* 中提取的，它能特异性地结合糖类中某些特定的结构。凝集素亲和层析是一种亲和层析，其中通过将粗提物通过包含共价连接的葡萄糖残基的珠子柱来纯化植物蛋白刀豆蛋白 A。由于它对葡萄糖具有亲和力，刀豆蛋白 A 将与这种类型的柱子结合。然后添加浓缩的葡萄糖溶液，以将结合的刀豆蛋白 A 从柱子中去除。
• 亲和层析是一种相当可行的技术，因为葡萄糖残基和目标蛋白之间具有高度的选择性，从而产生了高回收率的纯化产物。
1• 在许多情况下，它可以是一个步骤的过程。
2• 该技术可用于低浓度物质。
3• 在避免污染的同时实现快速分离。
4. 与凝胶过滤层析和离子交换层析不同，亲和层析可以一次分离一种特定蛋白，而其他技术则分离具有相似特性的蛋白。
• 必须仔细确定目标蛋白和配体的相互作用。这个过程需要昂贵的材料、时间以及少量的一次性处理蛋白质。
生物化学，Berg，第 6 版，ISBN 0-7167-8724-5
Clontech，http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_id=10594&tabno=2