结构生物化学/DNA重组技术/Southern印迹
Southern印迹，以其发明者埃德温·萨瑟恩命名，是一种在分子生物学中常用的技术，用于分离和表征DNA。通过以下步骤，它可以有效地识别特定的DNA模式。Southern印迹是一种技术，用于通过琼脂糖凝胶电泳来确定混合物中是否存在特定的DNA序列。
Southern印迹是一种杂交技术，使研究人员能够确定DNA样本中是否存在某些核苷酸序列。
Southern印迹是首创的此类技术。然而，不久之后，被称为Western印迹和Northern印迹（以及其他技术）的类似技术就巧妙地以同名方式命名；密切遵循Southern印迹命名背后的惯例。这些技术不检测DNA的存在，而是检测蛋白质和RNA的存在，分别。
DNA用一种或多种限制性内切酶消化，然后根据大小通过琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳分离得到的片段。将DNA变性，并从凝胶转移到固体支持物上。将DNA片段转移到固体支持物（通常是硝酸纤维素板）上的原因是，DNA在嵌入凝胶中时无法被DNA探针接触。在将DNA片段转移到滤膜的过程中，它们的相对位置得以保留。然后，将附着在滤膜上的DNA片段暴露于一缕放射性标记的DNA，该DNA与板子上感兴趣的DNA链互补。然后使用放射自显影来定位与探针互补的条带的位置。
1. 如果需要，DNA样本用合适的限制性内切酶或限制性内切酶消化。然后，将消化产物通过琼脂糖凝胶电泳分离。如果样本中存在大量的限制性片段，样本可能更像微弱的涂抹而不是离散的条带。
- 凝胶电泳
到了1970年代，DNA片段是通过重力分离的。在那之后，科学家们发现了分离DNA片段的其他方法。那就是凝胶电泳。电泳利用电来分离不同大小的分子。
2. 然后对消化产物进行变性，以便转移到膜上。由于样本DNA是双链的，只有单链DNA可以转移，因此必须通过浸泡在合适的碱性溶液（例如0.5M NaOH）中使样本变性。如果样本仍然太大而无法转移（超过15kb），则可以通过用适当的酸处理样本以脱嘌呤（例如，去除嘌呤）并将其分解成更小的片段。然后在继续操作之前将样本中和。
3. 将样本转移到膜上，该膜是用于分析的特殊吸墨纸。转移到另一层膜上是为了在电泳结束后保留DNA片段的位置。通常使用硝酸纤维素膜，尽管有些人可能更喜欢使用尼龙膜，因为它具有更好的结合能力。还可以注意到尼龙比硝酸纤维素更耐用。将使用的膜放在凝胶顶部，通常在膜顶部放置纸巾以确保通过均匀施加压力来均匀分布。转移通常通过毛细管作用完成，这可能需要几个小时。或者，可以使用真空装置；这与毛细管作用非常相似，但通过真空装置转移可能更快。转移也可以通过电泳使DNA从凝胶中移出并转移到膜上，这个过程称为电转移。
4. 然后用紫外线照射样本，使样本不可逆地共价交联到膜上。或者，样本可以在大约80°C下烘烤几个小时（如果使用尼龙膜，只能这样做，因为硝酸纤维素极易燃）。
5. 然后用标记的单链DNA（这是目标DNA序列）探测膜。此过程也称为杂交。标记的DNA通过互补链的结合与膜DNA结合。标签通常是32P探针标签，但也可以使用生物发光探针或生物素/链霉亲和素。杂交之所以重要，是因为它允许您实际看到它。需要注意的是，在杂交之前，应该进行预杂交过程以限制标记的DNA与特定位点的结合，否则标记的DNA可能会与样本中不想要或不重要的位点结合。为此，使用经不同浓度的SSC、SDS和甲酰胺处理的鲑鱼精子DNA。
- 32P标记
用限制量的DNase处理您作为探针使用的dsDNA片段，这会导致DNA中出现双链缺口。在DNA聚合酶 I中添加32P、dATP和其他dNTP，该酶具有5'到3'聚合酶活性以及5'到3'外切核酸酶活性。
6. 分析结果。如果使用32P标记的探针，则将使用放射自显影或使用X射线胶片来分析样本，以揭示样本中是否包含目标DNA序列。如果目标序列确实存在，X射线胶片将显示出由32P放射性标记探针的β发射引起的黑色条带。样本中与目标序列非常相似的序列也将显示出来。如果使用生物发光探针，则发光将是一种可视化方法。如果使用生物素/链霉亲和素，则通过比色法分析样本，或通过观察膜上颜色的显现来分析样本。
方法概述 : 首先，通过琼脂糖凝胶电泳分离限制性片段混合物，变性形成单链DNA，然后转移到硝酸纤维素薄片上。DNA片段在凝胶中的位置在硝酸纤维素薄片上得以保留，因为它直接从琼脂糖凝胶上印迹到薄片上。接下来，将这些片段暴露于32P标记的单链DNA探针，该探针与具有互补序列的限制性片段杂交。杂交后，放射自显影显示限制性片段-探针双链体的位点，最终显示出DNA片段的身份。
Nisha Patel，UCSD儿科，Sander实验室完成的Southern印迹照片上传者：Patrick Phuong，UCSD，Sander实验室
如上所述，Southern印迹法利用DNA探针来检测互补的靶DNA序列的存在。在本例中，Southern印迹法使用来自小鼠群体的雄性小鼠的DNA进行。Southern印迹法是一种追踪每一窝新小鼠的遗传构成以及老小鼠基因型的有效方法。从图中可以看出，杂合子、突变体和小鼠野生型都可以通过其印迹片段中出现的条带类型来区分。杂合子小鼠同时拥有上下两条带的序列，而突变体小鼠只有下条带。野生型小鼠只有探针检测到的上条DNA。左侧是DNA标准品，用于展示不同大小的DNA的迁移情况。顶部标签显示了小鼠系和生下这窝小鼠的母鼠编号，其DNA正在被印迹。
Southern印迹法的应用
[edit | edit source]通过使用这种技术，我们能够在一个高度复杂的混合物中检测单个特定的限制性片段，这些片段是由限制性内切酶切割整个人类基因组产生的。在如此复杂的混合物中，许多片段具有相同或几乎相同的长度，因此在电泳过程中会一起迁移。
确定DNA样本中是否存在特定序列的能力可以应用于多种用途。例如，Southern印迹法可以用于确定特定生物体基因组中特定基因的存在和数量，这也揭示了特定片段的分子量。由于该方法所涉及的步骤，特定限制性内切酶的限制性位点是否存在也可以被确定。它还可以用于比较探针序列与样本之间的相似程度。
Southern印迹法还可以用于追踪选定基因的遗传。限制性位点内的突变会改变限制性片段的大小，因此，Southern印迹分析和放射自显影中条带的位置也会发生变化。这种位置变化之后可以与正常的印迹分析进行比较，以揭示可能发生变化的位置。由这些突变在人群中产生的遗传多样性，被称为多态性。检测到的突变反过来可能会产生不同的影响。它可能会导致疾病，也可能与导致疾病的基因密切相关。这类疾病的一些例子包括镰状细胞性贫血、囊性纤维化和亨廷顿舞蹈症。所有这些突变都可以通过比较限制性片段长度多态性与正常的DNA片段来检测。
常见的误解/区别
[edit | edit source]如前所述，Southern印迹法衍生出其他分析方法，如Western印迹法和Northern印迹法，分别对应于蛋白质和RNA的检测。很多时候，这些技术的名称会被错误地互换，更重要的是，人们会错误地认为它们使用相同的方法组件[例如仪器、化学物质等]。重要的是要认识到，虽然这些方法非常相似，但它们的不同之处在于每种技术都是针对特定的生物大分子；因此，它们的处理方法也不同。
举个简单的例子，考虑一下Southern印迹法与Northern印迹法的基本区别。虽然两者都在最后一步使用放射自显影来可视化荧光标记，但它们的标记实际上是不同的。Southern印迹法使用32P标记的DNA探针与特定的DNA序列相互作用，而Western印迹法使用放射性标记的抗体与特定的蛋白质相互作用。其他例子包括用于转移电泳后生物大分子不同的膜类型[Southern印迹法使用硝酸纤维素膜；Western印迹法使用聚合物膜]，甚至用于电泳本身的凝胶类型[Southern印迹法使用琼脂糖凝胶；Western印迹法使用SDS凝胶]。为了避免混淆，Southern、Northern和Western印迹法也可以分别称为：DNA、RNA或蛋白质印迹法。
参考文献
[edit | edit source]Bartlett, Linda. "技术：重组DNA：Southern印迹法。" 图片。visualsonline.cancer.gov 2001年1月1日。2009年10月14日。<http://visualsonline.cancer.gov/details.cfm?imageid=2016>
Berg, Jeremy M., Lubert Stryer和John L. Tymoczko。生物化学。第6版。波士顿：W. H. Freeman & Company，2006年。