结构生物化学/蛋白质/合成

合成长度超过 50 个氨基酸的肽的最常用方法是自动固相肽合成。R. Bruce Merrifield 最初开发了这种方法，它可用于DNA 和RNA。为了开始这个过程，所需序列的羧基末端氨基酸被锚定到聚苯乙烯珠上，肽从 C 末端到 N 末端反向合成（与从 N 末端到 C 末端的常规序列相反）。然后，通过用三氟乙酸 (CF3COOH) 和二氯甲烷 (CH2Cl2) 洗涤来去除该氨基酸的 t-Boc 保护基团，这不会破坏共价键。接下来，将具有 t-boc（二叔丁基二碳酸酯）、保护的 N 末端和 DCC（二环己基碳二亚胺）活化的 C 末端的下一个氨基酸添加到反应柱中。在形成肽键后，过量的试剂和二环己基脲用合适的溶剂洗掉。为了延长肽链，以相同的方式继续添加下一个氨基酸。在合成结束时，通过添加氢氟酸 (HF) 从聚苯乙烯珠上释放肽，HF 会裂解酯键而不会破坏肽键。此时，赖氨酸或组胺等反应性侧链上的保护基团也会被去除。除了自动化之外，这种方法的巨大优势在于纯化步骤。由于杂质没有与反应柱结合，因此可以在不损失合成产物的情况下将它们洗掉。在实验室中，这种技术用于合成药物，如胰岛素。

过程

转录

它从细胞核开始。它与DNA 复制过程非常相似，在该过程中，DNA 被解旋酶“解开”，产生一条准备复制的核苷酸链。

转录 3 步总结 -> 从 DNA 生成 RNA 信息

(A) 结合和起始

DNA 转录单位分为 TATA 盒和增强子区域。TBP 与 TATA 区域结合，其他转录因子（与该区域结合的蛋白质）如 TFIIA 和 TFIIB 也与 TATA 区域结合。除非先与转录因子结合，否则 RNA 聚合酶无法直接与 DNA 结合。当 RNA 聚合酶与增强子区域（或称为起始位点）结合时，转录开始，通过需要 ATP 能量将其分成两条链，起始启动 DNA 链开始转录的位置。

(B) 延长

RNA 聚合酶通过执行两步延长步骤沿着 DNA 启动子区域移动

1) 它以 3.4 A 的速度解开（解开）双螺旋 DNA 约 10 个碱基。

2) 在不断增长的 RNA 的 3' 末端添加核苷酸。

当 RNA 聚合酶移动时，不断增长的 mRNA 分子被复制为碱基对碱基。转录大约每秒进行 60 个核苷酸。DNA 的核苷酸腺嘌呤将与 RNA 的尿嘧啶碱基互补。DNA 的核苷酸鸟嘌呤将与胞嘧啶配对。

(C) 终止

转录在 RNA 聚合酶到达终止位点时进行。不再添加 RNA 核苷酸，并且释放 mRNA。因此，mRNA 将从细胞核移到细胞质中，以便在蛋白质合成中进一步使用。

翻译

该mRNA 密码子翻译成氨基酸多肽链，分为三个步骤。

翻译的 3 步一般指导

起始 2. 小亚基核糖体附着到 mRNA 上。核糖体的大亚基与小亚基结合，A 位点（tRNA 的入口）和 P 位点（tRNA 的离开门）首先附着到一个 tRNA 上。反密码子（tRNA 中的三联体核苷酸）附着到 A 位点（入口位点）以与来自 mRNA 的 3 个核苷酸密码子配对。tRNA 携带一个氨基酸。如下图所示，tRNA。在顶部携带一个氨基酸

延伸 3. 启动 tRNA。然后移动到 P 位点，A 位点打开，以供第二个三联体编码的 tRNA 进入，以及另一个氨基酸。第二个 tRNA 结合到 A 位点后。然后通过肽键将氨基酸连接在一起。之后，第三个 tRNA 在第二个 tRNA 之后进入。移动到 P 位点。（从 3'' 到 5'' 移动） 4. 核糖体酶将氨基酸连接成一条链。这个过程将持续到遇到终止密码子（UAA）为止。

终止

5. 遇到终止密码子（UAA、UAG 或 UGA）。一种称为释放因子的蛋白质与 A 位点的终止密码子结合。核糖体在多肽链的末端添加一个水分子。6. 核糖体解离成其组成部分

优势

高产率和高纯度。所有反应都在单个容器中进行，消除了因反复转移产品而造成的损失。该方法适用于合成长链肽（50 个残基以上）。

合成肽

通过将一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基连接可以合成肽；这是一种缩合反应的例子。缩合反应是两个分子结合在一起，释放水，形成一个分子的反应。

肽合成可以是特异性的；这意味着可以形成特异性/所需的产物。为了制造独特的产物并防止副反应，使用保护基团，如叔丁氧羰基 (t-Boc)。T-Boc 用于简单肽形成的第一步。为了阻断 α-氨基，该保护基团与 α-氨基反应形成一个称为叔丁氧羰基氨基酸的复合物。阻断氨基之后，活化相同氨基酸的羧基。羧基被二环己基碳二亚胺 (DCC) 活化。

现在，对第一个氨基酸的氨基和羧基进行改变后，可以将第二个氨基酸连接到第一个氨基酸上。第二个氨基酸具有一个游离氨基，这意味着没有被阻断，它与第一个氨基酸的活化羧基连接；形成坚固的肽键并释放二环己基脲。新形成的二肽的羧基用 DCC 活化，并准备好与具有游离氨基的第三个氨基酸反应。同样，形成新的肽键并释放二环己基脲。这个过程可以连续进行，直到合成所需的肽。为了结束合成，添加稀酸，它会去除 t-Boc 并使肽不受干扰。

固相法用于形成含有 50 个以上氨基酸的合成肽。它涉及将最后一个氨基酸的羧基结合到聚苯乙烯珠上。锚定氨基酸的 t-Boc 被去除，然后将具有 t-Boc 保护氨基和 DCC 活化羧基的下一个氨基酸添加到与聚苯乙烯珠结合的氨基酸中。肽键形成，用聚苯乙烯珠的肽被过滤和洗涤，因此肽在继续合成之前是纯的。以下氨基酸以相同的方式连接，直到合成所需的肽。最后，使用氢氟酸 (HF) 从珠子上去除完成的肽。

肽连接用于合成超过 100 个氨基酸的肽。长肽由两个或多个没有保护基团的小肽形成。天然硫醇连接是最强大、应用最广泛的肽连接方法。长肽由 C 端羧基带有硫酯基团的肽和 N 端带有半胱氨酸的肽形成。一个肽的 C 端羧基上的硫酯基团与另一个肽的 N 端上的半胱氨酸反应形成硫酯连接的中间体。然后，中间体发生重排（S->N酰基转移）形成肽键。通过这种过程将小尺寸的无保护肽连接起来，以合成长肽。

应用

合成肽用于多种目的。这些肽可以作为抗原，刺激机体的免疫系统产生针对该肽的抗体。然后，这些抗体可用于分离蛋白质。肽还可以分离激素受体。

合成肽还可以用作药物。例如，加压素的合成类似物，也称为 1-脱氨-8-D-精氨酸加压素。这种合成肽用于治疗缺乏加压素激素的尿崩症患者，该激素会导致他们从体内排泄过量的液体。通过使用加压素类似物替代天然加压素，可以治疗这些患者。

File:Vasopressin.jpg

最后，合成肽可以用于更好地理解蛋白质的 3D 结构。使用合成蛋白质来研究蛋白质的 3D 结构非常有用，因为这些肽可以包含许多正常蛋白质中不存在的氨基酸；这意味着这些肽不局限于 20 种标准氨基酸。这导致了更多样化的结构。

固相肽合成

多肽合成可以实现自动化，被称为 Merrifield 固相肽合成，它使用聚苯乙烯固体载体来支撑肽链。聚苯乙烯是一种聚合物，其亚基衍生自乙烯基苯。

聚苯乙烯珠在干燥时不溶且坚硬；然而，它们在某些有机溶剂（例如二氯甲烷）中会膨胀。因此，试剂能够轻松进出聚合物基质。聚苯乙烯上的苯基通过亲电芳香取代进行官能化。

File:Electrophilic Chloromethylation of Polystyrene.jpg

以二肽为例，在氯甲基化聚苯乙烯上进行肽的固相合成如下。

1. 连接保护的氨基酸

2. 脱保护氨基末端

3. 与第二个保护的氨基酸偶联

4. 脱保护氨基末端

5. 将二肽从聚苯乙烯上断开

二环己基碳二亚胺 (DCC) 的作用

二环己基碳二亚胺 (DCC) 特别用于肽合成，以激活羧酸根的亲电性。这使得 C 端更易于作为其他氨基酸的连接位点。然后，带负电荷的氧将作为亲核试剂攻击 DCC 中的中心碳。这种中间体最终将转化为尿素，这是一种稳定的最终产物，在剩余的肽合成过程中相对不反应。此外，如果未正确监测，DCC 的活化能力有时会使肽键外消旋，因此有时可以使用不会外消旋肽立体化学的三唑。

File:Solid-Phase Synthesis of Peptide.jpg

固相合成的优点

固相合成的优点在于，由于所有中间体都固定在聚苯乙烯上，因此可以轻松地分离产物。因此，产物可以通过过滤和洗涤进行纯化。重复脱保护-偶联过程能够合成更大的肽。Merrifield 设计的一台机器能够自动执行一系列操作。

保护基团

肽键可以由氨基酸主链上的羧基和氨基形成。它也可以由侧链形成以合成不需要的肽。为了合成所需的肽，保护基团用于防止形成不需要的产物。它们还防止反应中使用的过量氨基酸聚合。保护基团还有助于确保某些氨基酸的立体化学保持不变。如果未正确保护，氨基酸的构型可能会发生立体异构体变化或外消旋。

叔丁氧羰基 (t-Boc) 保护基团

它用于保护 N 端氨基以及赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链。二叔丁基碳酸酯与氨基酸的 NH₂ 反应形成 t-Boc-氨基酸。t-Boc 基团可以在酸性条件下脱除。通常，它们用强酸或三氟乙酸 (TFA)（CF₃COOH）处理。在实验室中，Boc-氨基酸也可以买到，因为它可以大量合成。合成肽的人不需要自己合成 Boc-氨基酸。固相合成是有效的，因为它允许蛋白质保持在原始结构构型中，而不是被复杂的二级或三级分子间相互作用所影响。